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纳米抗体定制

羊驼纳米抗体制备技术支持客服

钟鼎生物以CRO为核心业务,在抗体发现领域深耕多年,具有成熟完善的技术。2012年公司组建羊驼单域抗体研究中心,2014年推出纳米抗体开发服务。随着2018年第一个纳米抗体药物Cablivi被EMA批准上市,国内外各药物研究机构对纳米抗体开发的需求日益增多。钟鼎生物可以提供抗原制备、羊驼免疫、PBMC分离、cDNA制备、抗体库构建筛选、纳米抗体表达纯化、抗体人源化等一站式服务。

我们的优势

专家级别的技术平台 专家级别的技术平台
博士为主导的核心研发团队,近20年经验。
完备的上下游服务 完备的上下游服务
提供从抗原制备、羊驼免疫、PBMC制备、抗体库构建筛选、抗体人源化等服务。
强劲有力的硬件平台 强劲有力的硬件平台
进口设备,进口试剂原料耗材,训练有素的工程师。
外包经验丰富 外包服务经验丰富
钟鼎生物以定制CRO服务为核心业务,具有丰富的外包经验。


羊驼免疫流程

免疫原检测 免疫原检测,免疫前采血。
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皮下免疫 皮下多点免疫5次
(从第2次免疫开始,效价检测、PBMC分离、RNA提取)
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血清效价 血清效价检测。
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抗体库构建 采集50ml外周血,用于纳米抗体库构建。

羊驼要求
雌性健康羊驼,15-20月龄,体重50kg左右。

抗原要求
A.抗原纯度
高纯度的抗原在产生免疫应答与筛选过程至关重要,因此建议客户抗原纯度在90%以上。我们在收到客户抗原后,会通过SDS-PAGE检测抗原纯度。
B.抗原量
细胞抗原免疫剂量为1.5x10e7 细胞/次/只,5次免疫共需细胞7.5x10e7细胞/只。
蛋白抗原首次剂量为1 mg/只,加免剂量为0.5 mg/次/只,免疫共需蛋白3 mg/只,效价检测用抗原0.1 mg ,每只动物所需蛋白抗原量为3.1 mg 。
不同抗原的需求量不同,请提前与技术人员沟通。同时客户不得隐瞒抗原是否具有致病、致死危险,如有隐瞒且造成实验动物死亡客户需要额外支付动物和项目成本费。
C.抗原浓度
抗原浓度大于0.5 mg/mL,且不含叠氮钠。

备注
不是所有的抗原都能使动物产生免疫应答,如果经过3~4次免疫后检测血清ELISA效价(OD450≈1.0)小于5000,建议终止项目,不再进行抗体库的构建与筛选。


纳米抗体制备服务步骤及交付标准

步骤 周期 交付材料 询价
1.动物免疫 详情请咨询QQ或拨打热线400-066-8086技术支持客服
A.5次动物免疫
B.效价检测
C.PBMC分离
D.RNA提取
E.cDNA制备
92天 5次免疫效价检测数据
5次免疫之后的cDNA
2.构建噬菌体抗体库  5折
A.利用免疫羊驼的cDNA,扩增出VHH基因片段,构建M13单链丝状噬菌体展示纳米抗体免疫文库。
B.抗体库质量:
(1)VHH抗体片段有效插入率﹥99%
(2)抗体库容量达到109次方
C.从文库中随机挑取96个克隆,对其中30个克隆测序,分析VHH抗体片段的多样性和正确率,保证正确率≥80%,另外提供30个克隆用于测序验证。
4-6周 提供质检报告与抗体库
①完整的项目报告和原始数据,报告需包含实验流程、分析评估实验的主要操作步骤、以及详细的实验结果;
②共30个文库随机克隆的甘油菌和测序引物;
③噬菌体展示纳米抗体免疫文库的Kit(包含文库甘油菌1ml × 10支和文库噬菌粒质粒10 μg);
3.抗体库筛选  5折
A.筛选方案确定:根据项目实际情况,选择不同的筛选方案,如竞争筛选,固相筛选,液相筛选,细胞筛选,负筛选等筛选方法。
B.淘选: 对抗原蛋白进行SDS-PAGE分析验证,并进行生物素标记;针对生物素化靶点蛋白,利用链霉亲和素预包被的ELISA Plates,淘筛免疫文库;抗原施压法进行2-3轮淘筛,确定充分富集且靶点筛选组的滴度要远高于对照筛选组。
C.结合筛选:选择从Output克隆中,分别挑取940个单克隆进行阳性克隆鉴定。经培养和Phage Rescue后,进行Monoclonal Phage ELISA检测。
D.测序分析:鉴定出抗原结合强阳性的VHH抗体克隆,测序分析,比对序列制作进化树,选择序列独特的克隆。
E.表达验证:少量表达阳性VHH克隆,利用Soluble ELISA检测对靶点抗原的特异性结合能力。
6-8周 10个以上的特异性克隆
4.纳米抗体表达纯化
A.将纳米抗体基因克隆至真核或原核表达载体。 2周 高纯度纳米抗体100-500μg
5.亲和力测定
采用Biacore 测定抗体的亲和力
采用Nicoya LSPR 测定抗体的亲和力
采用Fortebio octet 测定抗体的亲和力
1周
1周
1周
亲和力测定数据
6.纳米抗体人源化(通过自主开发软件AbsYs分析抗体可变区并进行抗体人源化设计。)
A.识别FR、CDR、关键残基、PTMs。
B.通过同源比对,考虑可变区一致性及相似性、关键残基、PTMs、稳定性等因素,选择更好的人源抗体Germline FR作为模板,与羊驼CDR 重组,设计初始人源化抗体。
C.分析抗体序列和结构,确定需要回复突变的关键残基,设计不同数量的回复突变VH。
D.将人源化基因克隆至真核表达载体,转染293瞬时表达获得100-500μg 纯化抗体。
E.结合活性及亲和力检测。
6-8周 至少一个人源化抗体(亲和力、表达量与原纳米抗体相当)

保密性说明

南京钟鼎生物技术有限公司拥有众多商业合作伙伴,深知保密工作对这些公司的重要性,我们极度重视保密性,在与您沟通之前先签署保密协议,并采用多重的防火墙及保障举措,以保护您的隐私权。

保护您的商业机密是钟鼎生物最基本的职业素养!



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纳米抗体天然文库

钟鼎生物提供纳米抗体天然文库构建及筛选相关服务包括:

1.羊驼或骆驼血液收集,PBMC分离,RNA提取及cDNA制备;

2.纳米抗体噬菌体展示文库构建;

3.纳米抗体筛选;

4.纳米抗体表达(原核或真核系统)及纯化。

钟鼎生物亦可以提供制备天然纳米抗体文库的相关原料::

1.已制备的来源与羊驼及骆驼PBMC的cDNA;

2.来源于5只动物脾脏的高质量的纳米抗体天然文库。