本项目为噬菌体展示纳米抗体文库的筛选案例，分为淘选、Phage ELISA筛选、Phage中和活性筛选、中和活性Soluble ELISA检测、进化树分析几步。

一、淘选

利用噬菌体展示A纳米抗体文库，针对A免疫抗原进行三轮体外定向筛选，结果如下所示。

Round	Conditions	Input	Output	Enriching factor
1st-P	Target protein: A免疫抗原(5μg/mL) Blocking: 2% Milk-PBST Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5   Neutralization: 1M Tris-HCl	1.13×1012	5.04×108	2.24×103
2nd-P	Target protein: A免疫抗原(2μg/mL) Blocking: 2% Milk-PBST Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5  Pre-counter select: 2% Milk	1.18×1012	7.92×108	1.49×103
2nd-N	Target protein: No Coating Blocking: 2% Milk-PBST Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5 Pre-counter select: 2% Milk	1.08×1011	3.04×104	3.55×106
3rd-P	Target protein: A免疫抗原(2μg/mL) Blocking: 2% Milk-PBST（预吸附） Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5 Pre-counter select: 2% Milk	6.53×1011	7.77×109	0.84×102
3rd-N	Target protein: No Coating Blocking: 2% Milk-PBST（预吸附） Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5 Pre-counter select: 2% Milk	6.53×1011	3.5×106	1.87×105

二、Phage ELISA筛选

1.Phage上清的制备

（1）分别从第一轮和第二轮出库的平板上个挑取2板（94*2）个单克隆菌落至1ml的2×YT-AI-hp培养基中，37℃，200rpm摇菌过夜。

（2）5000 rpm，10min离心。小心吸取上清600 μl分装到1.5ml离心管，即为phage ELISA待测样品。

2.Phage ELISA检测

（1）包被：A，0.1μg/ml，包被，4℃ 过夜。

（2）封闭：2%脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃1h。

（3）一抗：样品，10倍稀释，100ul/孔，37℃1h。

（4）二抗：Mouse anti HA tag mAb.1:10000,100μL/孔. 37℃1h。

（5）HRP：HRP conjugated Goat anti-Mouse IgG pAb 1:20000.100μL/孔. 37℃1h。

（6）显色：显色液.100ul/孔. 37℃.15min。

（7）终止：终止液.100ul/孔。

（8）读板：Antibody titer。

3.Phage ELISA检测结果

第一轮出库单克隆：

略

第二轮出库单克隆：

略

三、Phage中和活性筛选

分别挑取第一轮panning的43个阳性单克隆和第二轮panning的126个阳性单克隆Phage上清，进行中和活性检测。挑取的样品如下：

略

1.中和活性检测

（1）包被：A抗原, Recombinant，0.1μg/ml，100μL/孔，过夜。

（2）封闭：2%脱脂奶粉封闭，200 μL/孔，37℃1h。

（3）一抗：phage样品（一、二筛大于2），10倍稀释，100 μL/孔，37℃1h ， PBS作为对照 。

（4）受体：A, Recombinant (His Tag), Biotinylated，0.1 μg/ml 100 μL/孔，37℃1h。

（5）二抗：SA-HRP（钟鼎抗体部内部产品），1：10000，100 μL/孔， 37℃1h。

（6）显色：100 μL/孔，37℃，15min。

（7）终止：100 μL/孔。

（8）读板：Antibody titer。

2.中和活性检测结果

略

略

挑取数值最低的30株（红色加亮），即中和活性最好的30株，安排测序。共获得7个unique sequence的克隆。

四.中和活性Soluble ELISA检测

1.周质腔可溶性蛋白制备

  将上述7个unique克隆（in E.coli TG1），在37°C进行IPTG诱导表达，离心后收集菌体，进行周质腔可溶性蛋白抽提。

（1）从每管单克隆菌液吸取10 μL加入到1 mL 2×YT-AG（氨苄100 µg.ml-1和葡萄糖2%），37℃，200 rpm过夜。

（2）取0.4 ml过夜培养的单克隆菌液到20 ml的2xYT-AG（葡萄糖0.1%）中，37℃，220 rpm，培养约2.5 h，至对数生长期。

（3）3000 rpm离心15 min弃上清。加入20ml的2×YT-AI（IPTG终浓度为1mM），30°C，200 rpm过夜。

（4）3000 rpm，离心15 min，丢弃上清，用0.5 ml 预冷1×TES重悬沉淀，冰上放置15 min，再加入 0.75 ml 预冷 1/5 × TES，充分混匀。冰上放置30 min。

（5）13,000 rpm ，4 °C，10 min离心，小心吸取上清转移到新的离心管，即为周质上清。

2.周质腔可溶性蛋白检测

  上清经10倍起始，5倍稀释后，共8个梯度，取100 μL分别对包被了A免疫抗原(0.1μg/ml/well)的ELISA wells进行检测，同时用非相关的含有hig-tag的蛋白、其他项目的Soluble上清（250倍稀释）和1×PBS做阴性对照。

（1）包被：A抗原 Recombinant，0.1μg/ml，100μL/孔，过夜。

封闭：2%脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃1h。

（3）一抗：Soluble样品，100μL/孔，37℃1h，PBS作为对照。

（4）受体：A (His Tag)， Biotinylated，0.1μg/ml，100 μL/孔，37℃1h。

（5）二抗：SA-HRP（抗体部提供），1：10000，100 μL/孔，37℃1h。

（6）终止：100μ l/孔。

（7）读板：Antibody titer。

3.中和活性Soluble ELISA检测结果

略

根据ELISA结果，7个抗体均具有中和活性，达到项目预期。

五.进化树

对筛选获得的7个具有中和活性的抗体，进行进化树分析，结果如下：

略

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