摘要

　　以cDNA为模板，利用羊驼VHH抗体primer扩增VHH片段；将VHH片段插入pComb3XTT噬菌粒载体，并转化到E.coli TG1，构建噬菌体展示VHH抗体免疫文库，库容>109；从文库中随机挑取30个克隆，进行序列测定和分析，确保文库中90%以上的克隆包含目的插入序列。

实验设计

采用M13噬菌体展示系统构建文库，该系统由pComb3XTT噬菌粒载体、E.coli TG1和M13KO7辅助噬菌体组成，pComb3XTT噬菌粒载体的结构如图1所示。6×His标签、HA标签和gene III序列之间有一个琥珀终止密码子，在琥珀终止密码子抑制型菌株（例如E.coli TG1）中有10%~20%的琥珀终止密码子能够翻译为谷氨酸（Glu，或E），导致VHH与pIII蛋白融合表达。当利用辅助噬菌体M13KO7拯救后，VHH抗体得以展示在噬菌体尾部pIII蛋白的N末端。

采用M13噬菌体展示系统构建文库，该系统由pComb3XTT噬菌粒载体、E.coli TG1和M13KO7辅助噬菌体组成，pComb3XTT噬菌粒载体的结构如图1所示。6×His标签、HA标签和gene III序列之间有一个琥珀终止密码子，在琥珀终止密码子抑制型菌株（例如E. coliE.coli TG1）中有10%~20%的琥珀终止密码子能够翻译为谷氨酸（Glu，或E），导致VHH与pIII蛋白融合表达。当利用辅助噬菌体M13KO7拯救后，VHH抗体得以展示在噬菌体尾部pIII蛋白的N末端。

图1 噬菌粒pComb3XTT质粒图谱

实验材料

1)羊驼外周血淋巴细胞cDNA；
2)PCR扩增、限制性内切酶、T4 DNA连接酶等工具酶主要购自Thermo Scientific和New England Biolabs等公司；
3)pComb3XTT、E.coli TG1、Help phage M13KO7等实验材料由钟鼎保存。

实验结果

4.1.VHH文库片段的制备

以cDNA为模板，使用引物扩增羊驼抗体片段，取适量PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2-A所示：PCR产物有两条带，目标条带分子量大小约为650-700 bp（图中箭头所示），另外在1000 bp处有一条非目标条带（传统抗体片段）。将PCR产物上样至琼脂糖凝胶，进行电泳分离，并利用凝胶回收试剂盒对目的片段（650-700 bp大小条带）进行切胶纯化回收。以上述胶回收产物为PCR的模板，扩增VHH文库片段，结果如图2-B所示：PCR扩增得到了大小与预期一致（约为400 bp）的目的条带。VHH文库DNA片段回收纯化后，经Pst I/Not I双酶切，纯化回收定量后，分装保存用于后续实验。

图2-A 羊驼抗体片段PCR扩增

图2-B 羊驼VHH纳米抗体片段PCR扩增

电转化和文库构建

将酶切后的载体与VHH片段进行连接反应。连接产物经纯化后，电转化到E.coli TG1，得到10 mL转化产物。取10 μL（即为10-2 ml）进行一系列10倍梯度稀释，并取10-4、10-5和10-6共三个梯度进行涂氨苄抗性平板计数，以评估文库库容，库容=克隆数×稀释倍数×转化产物总体积（ml）。结果如图3所示，三组梯度稀释平板的克隆数成梯度，-5和-6梯度（图4 B和C）的克隆数量分别为~1200和161个，平均后的库容为：[(1200+161)×105+161×106]÷2×15=2.2×109。剩下的转化产物全部涂布到Amp抗性平板培养过夜，次日刮下混匀后，加入20%终浓度的甘油，分装后冻存于-70℃。

图3 VHH文库的库容测定

4.3.免疫文库质量分析

从文库的梯度稀释平板上随机挑取30个单克隆，使用正向测序引物pComb3XTT-F对这些克隆进行测序，共得到29个有效测序克隆（另外四个克隆9号为套峰），原始测序结果见附件。对VHH片段的氨基酸序列进行比对分析，结果如图5所示：29个克隆中有28个含有正确阅读框架的抗体片段。文库总的正确率约为28÷30×100%=93.3%。利用MEGA软件构建了VHH片段的Neighbor-Joining Tree，结果如图4所示，从中可以看出，VHH片段多样性很好。综上所述，VHH文库的质量达到项目要求。

图4 VHH抗体库随机克隆测序结果

图5 VHH氨基酸序列的系统进化树图

项目总结

以cDNA为模板，经PCR扩增得到了VHH抗体基因片段，并分别在其5’端和3’端引入了SacI和SpeI酶切位点。经SacI/SpeI双酶切后，插入到经同样酶切的噬菌粒载体pComb3XTT中，并经电转化到E.coli TG1，得到了展示VHH的M13噬菌体展示文库，文库的库容为2.2×109。从文库中随机挑取30个克隆进行DNA测序分析，序列分析结果显示，文库的正确率约为93.3%。因此，本项目达到了预期目的，得到了库容量大、多样性好的M13噬菌体展示VHH免疫文库。

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