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双分子荧光互补 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)是一项可直观、快速判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该技术利用在荧光蛋白特定位点插入外源片段而不影响GFP荧光活性的特性，在其分割为两个无荧光活性的蛋白片段, 即N端片段（N-fragment）和C端片段（C-fragment），当能够发生相互作用的两个蛋白分别与N端片段和C端片段连接形成融合蛋白并在活细胞中共同表达时, 荧光蛋白的N端片段与C端片段就能够相互靠近, 重新形成活性的荧光基团而发出荧光。


技术原理

双分子荧光互补


BiFC系统：

1. Split fluorescent protein (YFP)普通型：
该系统适合蛋白相互作用较强的蛋白互作研究，YFP荧光强度控制在较低的水平，不受背景等因素干扰。

2. Split fluorescent protein (YFP)增强型：
该系统适合膜蛋白互作等蛋白之间相互作用较弱的蛋白互作研究，YFPn和YFPc经过人工编辑，YFP荧光增强，便于观察互作弱的荧光信号。同时对206位氨基酸A进行突变成K，降低了背景等因素干扰，结果真实可靠。

3. The Split luciferase （LUC）system：
该系统可以对活体系统观察拍照，尤其可进行定量分析，比较互作强弱，适合蛋白互作受第三方物质影响的互作研究，如蛋白互作的强弱能够被激素、小分子化合物等调节，通过外源添加激素化合物等观察判定互作的强弱变化。

服务流程

1、构建包含目的蛋白的质粒
需客户确认目的蛋白接在荧光蛋白的N端还是C端。
2、重组目的质粒转化农杆菌；
3、农杆菌菌液注射烟草叶片；
4、共聚焦显微镜观察和拍照。

双分子荧光互补检测服务
1. 表达质粒构建 周期 交付数据及材料 报价
  • 基因优化
  • 亚克隆设计
  • 合成基因
  • 亚克隆至载体
 载体构建
1-2周		 1、完整的实验报告，包括详细的实验步骤及结果
2、原始图片，包含YFP、 DIC、Merge 
3、构建好的质粒及农杆菌
 在线询价
2. BiFC实验  
  • 农杆菌转化
  • 互作蛋白瞬时表达
  • 实验结果观察拍照
 表达鉴定 
3-4 周

 

实验案例

实验目的：通过BIFC实验验证A、B蛋白能相互作用。

实验结果:

BiFC

  根据激光共聚焦显微镜拍摄荧光结果显示，实验组能够观察到黄色荧光信号，而对照组则无荧光信号。实验结果证实蛋白A和蛋白B间存在相互作用。



方法学评价

  • 优势：
    1、双分子荧光互补实验能够有效地鉴定蛋白质的相互作用，特别是可以检测低亲和力的蛋白相互作用。
    2、双分子荧光互补实验不需要以原位方式对样品进行标记，避免了样品结构和功能的改变。
    3、双分子荧光互补实验可以在真正的体内细胞环境中进行，对于分子生物学和生物医学研究具有重要意义。
  • 劣势：
    1、双分子荧光互补实验需要将两个受体分子各自连接到不同的荧光蛋白上，这个过程可能会导致蛋白的结构变化或功能损失。
    2、双分子荧光互补实验需要在相同的细胞或组织中表达两个融合蛋白，并且这两个蛋白的表达水平需要相等。因此，在实验设计和数据分析中需要考虑到这些因素的影响。
    3、双分子荧光互补实验对于某些靶标不适用，比如一些细胞膜结构和信号转导通道，这些结构可能阻碍荧光蛋白的结合。

技术交流

客户发表文章：

1、ICE1 of Poncirus trifoliata functions in cold tolerance by modulating polyamine levels through interacting with arginine decarboxylase




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