农杆菌侵染

　　农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口，受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达。Vir产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子。此单链分子从Ti质粒上脱离后，可以与Vir产物VIRD 2 蛋白共价结合，并在VIRD 4和VIRB等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。

农杆菌质粒载体

　　质粒载体系统中常用的质粒有：Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒存在于根癌农杆菌中，Ri质粒存在于发根农杆菌中。Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处。在实际操作中，大部分采用Ti质粒。

　　农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。T-DNA长度为12-24kb 之间，两端各有一个含25 hp 重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中。Vir区位于T-DNA以外的一个35 kb 内，其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。

农杆菌感受态细胞制备实验

实验原理:
　　在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

实验材料:
　　土壤农杆菌LBA4404菌株、YEB液体培养基、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、硫酸镁、氯化钙、利福平储液

实验仪器:
超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

实验步骤:
　　1.挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 ml的YEB液体培养基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振荡培养过夜。
　　2.取过夜培养菌液1 ml接种于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5。
　　3.取2 ml菌液，13 000 rpm，离心30 sec，弃上清。
　　4.加入1000 μl 20 mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30 min。
　　5.13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500μl预冷的20mMCaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24 hr内使用，或液氮中速冻1 min，置-70℃保存备用。

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