农杆菌侵染

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农杆菌侵染

  农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口,受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达。Vir产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子。此单链分子从Ti质粒上脱离后,可以与Vir产物VIRD 2 蛋白共价结合,并在VIRD 4和VIRB等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。

农杆菌图

农杆菌质粒载体

  质粒载体系统中最常用的质粒有:Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒存在于根癌农杆菌中,Ri质粒存在于发根农杆菌中。Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处。在实际操作中,大部分采用Ti质粒。

  农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。T-DNA长度为12-24kb 之间,两端各有一个含25 hp 重复序列的边界序列,在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中。Vir区位于T-DNA以外的一个35 kb 内,其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。

农杆菌感受态细胞制备实验

实验原理:
  在基因工程操作中,感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中,0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变,此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

实验材料:
  土壤农杆菌LBA4404菌株、YEB液体培养基、酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、硫酸镁、氯化钙、利福平储液

实验仪器:
超净工作台,恒温摇床,冷冻高速离心机,高压灭菌锅,冰箱,-70℃超低温冰柜,分光光度计,接种针,10ml试管,50ml离心管,1.5ml离心管,冰浴,微量进样器及吸头。

实验步骤:
  1.挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 ml的YEB液体培养基(含Rif 50 mg/l)中,28℃振荡培养过夜。
  2.取过夜培养菌液1 ml接种于50 ml YEB(Rif 50 mg/l)液体培养基中,28℃振荡培养至OD600为0.5。
  3.取2 ml菌液,13 000 rpm,离心30 sec,弃上清。
  4.加入1000 μl 20 mM CaCl2,使农杆菌细胞充分悬浮,冰浴30 min。
  5.13000rpm,离心30sec,弃上清,置于冰上,加入500μl预冷的20mMCaCl2,充分悬浮细胞,冰浴中保存,24 hr内使用,或液氮中速冻1 min,置-70℃保存备用。