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微量热泳动(MicroScale Thermophoresis,MST)是由基于Nano Temper 公司Monolith NT.115仪器检测分子互作,待检测的互作生物分子可以是蛋白-抗体,蛋白-蛋白,蛋白-DNA/RNA蛋白-小分子化合物等。

优点 缺点
相对于传统的GST-pull-down,Co-IP等实验来说,无需使用抗体,无需获得高纯度蛋白,直接使用Tris-NTA dye标记 His-Tag融合蛋白,即可上机进行检测。甚至膜蛋白、细胞质、细胞裂解液等复杂生物溶液也可以应用到MST检测中。 如果互作蛋白与其他分子形成复合体或者于其他分子存在竞争,都会影响结合数据;
如果蛋白存在翻译后的修饰,不同的体系检测的数据会发生漂移;
如果待测蛋白在实验体系的稳定性不佳,也会影响数据的稳定性。
相对于ITC、SPR 等非荧光检测法,MST热泳动检测无需获得mg级别的高纯度蛋白,无需固定样品,且样品用量在ug级别就能开展检测。
在植物科研领域,以往在转基因植株中过表达的GFP融合蛋白,无需纯化蛋白,直接使用组织裂解液,向其中加入梯度稀释的纯化蛋白,用直接用于互作检测,可以直接替代酵母双杂的点对点验证
不仅能定性两个生物分子的互作关系,还可以定量判断结合的亲和力强弱。。

一、MST热泳动检测基本原理

将其中一个互作分子(大多是蛋白)标记荧光染料或者融合GFP标签,将标记蛋白和配体分子按照特定的浓度梯度置于毛细管中,红外激光加热产生一个微观的温度梯度场发生热泳动,其水化层、分子大小、电荷等分子性质会随着热泳动发生改变,进而引起反应体系中荧光分布的变化。MST除了能精确检测生物分子间相互作用,通过计算解离常数(Kds),还能得到有关生物分子互作的其他参数,实现精确的定性分析。

MST工作原理

二、MST微量热泳动仪(Monolith NT.115)

  • MST仪器
  • MST光路示意图
  • MST检测信号
  • 结合曲线
MST仪器

NanoTemper Monolith NT.115 检测设备。下方为容纳 16 根毛细管的托盘。

MST检测流程

毛细管吸取约 4 μL 的反应体系。仪器通过物镜对毛细管内的荧光进行激发和检测。

MST检测信号

初始阶段,溶液中的分子均匀分布, 并检测这一阶段的荧光值。红外线开启后立刻出现脉冲升温,由于温度的快速改变,荧光团的分布也发生改变。随后,荧光分子远离红外线加热的区域。红外线开启 30s时出现典型的荧光变化。关闭红外线后,发生逆向的 T-jump,反应体系恢复均匀分布的状态。

结合曲线

荧光标记的分子(黑色曲线表示未结合)与未标记的配体结合后改变其自身的热泳 动(红色曲线表示结合),产生不同的检测曲线。用标准化的荧光值 ΔFnorm(ΔFnorm=Fhot/Fcold.)表示分子热泳动的变化(F 值指 粉色和蓝色光标所标注区间内的平均荧光值)。不同毛细管中逐渐增加未标记荧光的配体浓度,会产生不同热泳动检测信号, 利用 ΔFnorm 绘制出结合曲线

三、案例介绍

(1)模拟体内蛋白-蛋白结合对比实验

实验目的:验证X 与 野生型YWT ,X 与 突变型 YMu 两组蛋白的结合能力差异情况。
实验方法:将X蛋白作为配体蛋白, Y蛋白作为受体蛋白,用原核重组表达(体外结合)和过表达转染细胞(半体内)两种方式,使用MST技术,检测解离常数。
实验结论:突变的产生导致X 与Y蛋白的亲和力明显下降,说明结合能力减弱,体内体外数据一致。

模拟体内蛋白-蛋白结合对比实验的流程图

参考文章: A synergetic effect of BARD1 mutations on tumorigenesis Nature Communications (2021)

文献1图例
分割线

(2)转基因植物过表达融合GFP标签与蛋白的相互作用

实验目的:验证蛋白X与Y蛋白两个亚基Y1 Y2的结合能力。
实验方法:分别用Co-IP与MST的方法,利用过表达的植物裂解液与X重组蛋白结合,检测X蛋白与两个亚基的亲和力。
实验结论:植物裂解液Y1和Y2都能与X蛋白结合,其中Y1结合能力更强。

转基因植物过表达融合GFP标签与蛋白的相互作用的流程图

参考文章: Identification of Core Subunits of Photosystem II as Action Sites of HSP21 That Is Activated by the GUN5-Mediated Retrograde Pathway in Arabidopsis Plant Journal 2017

文献2图例

四、MST热泳动检测相关服务

基因功能研究整体解决方案 酵母双杂交 GST pull down Co-IP
抗体相关服务