酵母双杂交检测与文库构建

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酵母双杂交检测试验技术服务

     酵母双杂交能反映不同蛋白质在活细胞内的相互作用,以简便、灵敏和高效等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。钟鼎可提供适用于胞浆蛋白、核蛋白及膜蛋白的酵母双杂交实验服务,我们具有丰富的酵母双杂交技术服务的经验,可以很好的帮助客户分析并解决在实验过程中遇到的各种问题。

酵母双杂交原理

服务优势

酵母双杂交

酵母双杂交实验原理:

以Gal4 系统为例,BD和AD 分别由Gal4 蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4 系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时,DNA 结合结构域与靶蛋白即"诱饵"相结合,转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下,单独的BD 可以与GAL4 上游活化序列(GAL UAS)结合但不能引起转录,单独的AD 则不能与GAL UAS 结合;只有当BD 与 AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时,BD 与AD 才能与 GAL UAS结合并且引起报道基因的转录,从而激活下游报告基因,通过这一系列实验来验证两个蛋白之间的相互作用。

酵母单/双杂交检测服务项目列表

服务项目 说明 周期 服务报价
酵母单杂交文库构建技术服务 基于重组方法的文库构建方案(请参考本页详细说明 4-6周

请联系
400-066-8086
或QQ技术支持
QQ技术支持

酵母单杂交文库筛选技术服务 DNA—蛋白质相互作用(请参考本页详细说明) 12-15周
核蛋白体系酵母双杂交文库筛选技术服务 基于pDEST22或pGADT7系统 14-16周
膜蛋白体系酵母双杂交文库筛选技术服务 基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交系统 14-16周

酵母单杂交文库构建服务

酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中,识别与DNA特异结合的蛋白质,同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列,而无需分离纯化蛋白,实验简单易行。为了获得良好的酵母单杂交筛选实验结果,构建酵母单杂的文库至关重要,我们可以依据不同的实验需要及物种特性,选择不同的体系建库方法,我们的技术专家可以熟练的应用Clonetech的SAMRT方法和life的gateway方法建立,同时,钟鼎的技术专家也开发出了基于同源重组原理的建库方法。

酵母单杂交文库构建实验流程:
1.RNA提取
2.mRNA提取
3.cDNA的酶促法合成
4.cDNA连接接头
5.cDNA按长度分离
6.cDNA与酵母单杂交文库载体p重组
7.重组产物电转化
8.文库检测以及质粒提取

酵母单杂交文库构建实验材料要求:
客户构建指定的酵母单杂交cDNA文库,由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可: 细胞样本:细胞数量大于1*10^7; 动物样本:大于1g; 植物样本:大于2g; 总RNA:大于200ug。

产品质量标准:
原始文库库容量大于1*10^7CFU;
平均插入片段大于1000bp ;
克隆阳性率大于95%。

酵母单杂交文库筛选技术服务

在研究DNA—蛋白质相互作用中,酵母单杂交体系主要有以下3种用途:①确定已知DNA—蛋白质之间是否存在相互作用;②分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因;③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域,以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

客户仅提供用于筛选的诱饵质粒信息,我们完成杂交筛选相关工作
1.诱饵载体的构建
2.诱饵质粒的自激活检测
3.文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
4.文库筛选和3AT优化
5.文库筛选结果测序分析
6.筛选结果回转验证
7.详细报告的整理和数据发送

试验完成后提供完整的实验报告,包含实验原始图片,阳性克隆,测序鉴定结果,质粒及菌株等。

核蛋白体系酵母双杂交文库筛选技术服务

钟鼎生物的核蛋白体系酵母双杂交服务可以选择使用life的pDEST22和clonetech的pGADT7两套系统进行筛选,筛选文库可以使用预制商业化文库或者本公司定制构建的酵母杂交文库。
需要指出的是,融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录,因此对于胞外配体-受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言,该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时,假阳性结果常常干扰实验的准确性,除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外,细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用,因此双杂交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。

客户只需提供用于筛选的诱饵质粒信息,我们完成杂交筛选相关工作:
1.诱饵载体的构建
2.诱饵质粒的自激活检测
3.文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
4.文库筛选和3AT优化
5.文库筛选结果测序分析
6.筛选结果回转验证
7.详细报告的整理和数据发送

膜蛋白体系酵母双杂交文库筛选技术服务

该系统的原理是利用连接有泛素(ubiquitin)的蛋白能够被泛素特异性的蛋白酶(UBPs)识别并切割下泛素,而这种特异性切割只在泛素能够正确折叠的前提下发生。在正常情况下,泛素断裂成两部分后在体内能自发结合成可被UBPs识别的重构泛素,而当有突变发生时,即泛素的N端发生Ile13/Gly13的突变,这种断裂泛素的重构就无法进行。只有当与断裂的泛素的两部分分别连接一个蛋白,且两个蛋白之间存在相互作用,断裂泛素的重组又得以恢复。断裂泛素重组的发生能将连接在泛素C端的转录因子切割并进入细胞核内激活报告基因的转录表达,通过报告基因是否表达,可以检测两个蛋白之间是否存在相互作用

基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统,区别于传统的核蛋白互作分析,可用于研究膜蛋白间及膜蛋白与胞质蛋白间的互作。在酵母细胞中,泛素可以分成两部分表达,即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub),后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白体系

客户只需提供用于筛选的诱饵质粒信息,我们完成杂交筛选相关工作:
1. 诱饵载体的构建
2. 诱饵质粒的自激活检测
3. 文库质粒和诱饵质粒共转酵母感受态细胞
4. 文库筛选和3AT优化
5. 文库筛选结果测序分析
6. 筛选结果回转验证
7. 详细报告的整理和数据发送

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