双分子荧光互补技术服务是钟鼎生物在生物大分子互作研究领域新增加的服务内容,本文介绍了双分子荧光互补的原理,优缺点,实验流程(烟草体系）以及一些实验的注意事项,供大家参考。

BIFC原理

  在荧光蛋白（YFP、GFP、Luciferase等）的两个β片层间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。BIFC技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基因而发出荧光

BIFC技术的优缺点与应用

优点	缺点	应用
1.可视化 2.可应用到不同宿主 3.体内体外都可应用 4.背景干净，检测更加灵敏 5.对仪器要求低，成本可控	1.对温度敏感 2.信息滞后，无法实时观察互作	1.研究蛋白相互作用 2.蛋白互作的定位研究 3.蛋白质构型的研究 4.检测RNA

BIFC实验操作步骤

以烟草体系3为例，在烟草植株活体细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用

1.种植烟草。在 14 h 光照/10 h 黑暗，温度 25 C，相对湿度70%条件下培养大概4〜5周。

2.将含有目地基因的载体转入农杆菌中。
注意：GV3101、EHA105、LBA4404这三种农杆菌均有报道可以用于烟草瞬时转化。在培养农杆菌时候除了除了添加载体所含有的抗生素外，不同农杆菌还需要添加其它种类抗生素，比如GV3101还需要添加50μg/ml的利福平。

3.挑取含有目的载体的农杆菌单克隆至含有相应抗生素的5ml LB培养基中，在28℃, 200rpm的条件下培养2d。（新鲜转化的农杆菌单克隆在3mL培养基培养过夜至1d即可。）

4.转移1 ml培养的农杆菌菌液至20ml含有相应抗生素的LB培养基中扩大培养，该LB培养基含15μM乙酰丁香酮。在28℃，200rpm的条件下培养至农杆菌的生长对数期（OD₆₀₀=0.5-0.6）.

5.在室温，5000rpm离心10min以收集菌体，用浸染液（含10mM MgCl₂，10mM MES, 150μM乙酰丁香酮，pH = 5.6)悬浮农杆菌菌体至OD₆₀₀ =1.0。 室温静止2〜3h。（至少0.5h，至多不超过3h。）

6.等体积混合两种含有不同质粒的菌体，用1 ml的针头在烟草叶片背面轻轻点开一个小口（注意不要刺穿)，再用去掉针头的针管吸取菌液，从叶片伤口处注射到叶片中。用记号笔标记烟草叶片水溃状区域。

7.注射过的植株于21℃左右培养2d后观察烟草注射农杆菌的区域有无荧光。撕取烟草叶片标记区域（可以不撕，直接用刀挖出靠近伤口的叶片部分即可) 用激光共聚焦显微镜进行荧光的成像（叶片背面表皮细胞层较好观察)。

BIFC实验中的一些注意事项

1.选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射，太小的可能注射不进去，太老的表达效率较低。叶片气孔打开的时候比较容易注射，因此最好在白天注射.

2.农杆菌菌液浓度是需要自己摸索的—个参数，OD₆₀₀ =1.0并不—定适用于所有的基因，高浓度可能导致叶片死亡，或者影响定位结果，建议设置不同的浓度梯度进行比较，在可以获得荧光信号的前提下尽量采用低浓度的菌液。

3.不同外源基因的瞬时表达效率大不相同-这一点在单转做亚细胞定位的时候表现得特别明显，效率高者基本每次都能达到100%发光，低者可能转10次只能表达出一两次，建议在BIFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。

4.注射后的植株通常在2d之后观察，但不同基因表达的时间可能在1-7天不等。

  与其它研究蛋白与蛋白相互作用技术相比, 双分子荧光互补（BIFC）是一种简单、快捷的方法，拥有广阔的应用前景。钟鼎生物能够提供双分子荧光互补检测服务，高效跟踪蛋白质互作，助力科研，欢迎咨询。

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