21世纪初，随着微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）的发现，RNA研究领域迎来了新的热潮，RNA结合蛋白（RBPs）在RNA调控中的关键作用也进一步凸显出来。然而，传统方法难以直接捕获RNA与蛋白的动态结合。为此，借鉴了ChIP和Co-IP基于抗原-抗体特异性结合原理的RIP（RNA免疫沉淀）技术应运而生，它将目标锁定在RNA-蛋白复合物上。
RIP技术主要有两种应用方向。
其一，是以特定的RNA结合蛋白为中心，通过免疫沉淀筛选与该蛋白相互作用的RNA分子，从而揭示其潜在的RNA靶标。
其二，是用于验证已知的RNA与蛋白之间的相互作用，通常与RNA pull-down技术相结合。在RNA pull-down实验中，以感兴趣的RNA为中心，筛选与其结合的蛋白，而RIP则从反向角度验证RNA与蛋白的相互作用，为RNA-蛋白互作的研究提供有力支持。
其原理与ChIP相似，通过特异性抗体将细胞内与目标RBP结合的RNA-蛋白复合物免疫沉淀。具体步骤为：先用特异性抗体与目标RBP结合形成复合物，再加入结合了二抗的磁珠捕获复合物，使其结合到磁珠上。随后通过磁力分离并洗涤，去除杂质，得到纯化的与目标蛋白结合的RNA。最后提取RNA，反转录为cDNA，通过定量PCR或高通量测序等技术进行分析。
通常来说，RIP免疫沉淀的实验方案需要设置三组，即实验组（IP）、阴性对照组（IgG）、输入对照组（Input Control）。
输入对照（Input Control）：在实验开始时，取一部分细胞裂解液作为输入对照，不进行免疫沉淀，直接用于后续的RNA提取和分析。这个对照可以评估实验过程中RNA的损失情况，以及提供一个全细胞RNA的背景水平，用于比较免疫沉淀后富集的RNA量。
阴性对照抗体：使用非特异性抗体或无关蛋白的抗体作为阴性对照，例如使用IgG作为对照抗体进行免疫沉淀。这样可以验证富集的RNA是否与目标RNA有特异性相互作用，排除非特异性结合的影响。
细胞培养与收集：选择合适的细胞系进行培养，确保细胞处于对数生长期且状态良好。收集一定数量的细胞（通常至少需要25×10⁶个细胞），以保证足够的RNA和蛋白质用于后续实验。
细胞裂解：使用含有核糖核酸酶抑制剂的裂解液裂解细胞，释放细胞内容物。裂解过程中适当震荡有利于细胞充分裂解。
实验组（IP）设置：将裂解液与特异性针对目标RNA结合蛋白的抗体混合，使抗体与蛋白-RNA复合物结合。同时，设置使用阴性对照抗体的裂解液作为对照组。
RNA提取：从免疫沉淀复合物中提取RNA，确保RNA的完整性和纯度。通常使用TRIzol或类似试剂进行提取。
测序准备与分析：对提取的RNA进行文库构建，并进行高通量测序。测序后，通过生物信息学工具将测序数据与参考基因组或RNA数据库进行比对，识别并统计与目标蛋白结合的RNA序列。
数据质控与结果分析：检查测序数据的质量，包括测序深度、覆盖度及测序错误率等。使用实时荧光定量PCR（qPCR）等方法验证富集的RNA是否包含目标RNA，确保实验成功和结果可靠性。
1.以感兴趣的蛋白为中心筛选与之结合的RNA
SRSF6-regulated alternative splicing that promotes tumour progression offers a therapy target for colorectal cancer（IF=14.028）
在结直肠癌（CRC）的研究中，科学家们发现剪接因子SRSF6在CRC进展中扮演着关键角色。
研究者们首先对311份CRC样本以及癌症基因组图谱和基因表达综合数据库进行了全面分析，发现SRSF6在CRC样本中经常上调，并且与预后不良相关。为了探究SRSF6的功能，他们在体外和体内进行了功能分析，发现SRSF6能够促进CRC细胞的增殖和转移。接下来，作者通过RIP-seq鉴定SRSF6调控的可变剪切（AS）及其结合位点，揭示SRSF6在CRC样本中上调，并与不良预后相关，在体外和体内促进增殖和转移。鉴定出SRSF6调控的AS靶标，并揭示SRSF6结合位点。SRSF6通过直接结合到其23号外显子位点来调控ZO-1异常剪接，从而作为癌基因发挥作用。
图1：RIP-seq鉴定SRSF6调控的RNA结合motif
2. 验证RNA和蛋白的结合
Long noncoding RNA MEG3 induces cholestatic liver injury by interaction withPTBP1 to facilitate shp mRNA decay.（IF=14.679）
在研究长链非编码RNA MEG3在胆汁淤积性肝损伤中的作用时，研究者首先认识到胆汁酸代谢失调会导致胆汁淤积性肝损伤，而MEG3此前被证实是潜在的肿瘤抑制因子，但其在肝脏中的基本功能尚不清楚。
为了探究MEG3在肝脏中的作用，研究者使用RNA pull-down结合质谱技术，筛选出与MEG3结合的RNA结合蛋白PTBP1，并利用RIP技术进行验证。接着，通过生物信息学分析预测PTBP1在小异二聚体伴侣（SHP）编码区（CDS）内的结合位点，SHP是胆汁酸生物合成的关键抑制因子。在肝细胞癌细胞中强制表达MEG3，发现其可引导并促进PTBP1与Shp CDS的结合，导致Shp mRNA的衰变。在小鼠肝脏中瞬时过表达MEG3 RNA，引起了Shp mRNA快速降解和胆汁淤积性肝损伤，同时伴随胆汁酸稳态的破坏、肝酶升高以及胆汁酸合成酶和代谢基因的失调。进一步研究表明，SHP通过抑制MEG3启动子的cAMP反应元件结合蛋白（CREB）反式激活，从而抑制MEG3基因的转录。在人类纤维化和肝硬化肝脏中，MEG3和PTBP1的表达被激活。综上所述，MEG3通过作为引导RNA支架募集PTBP1，破坏Shp mRNA的稳定性，进而引起胆汁淤积，而SHP则以反馈调节的方式抑制CREB介导的MEG3表达激活。
图2.探究MEG3与PTBP1蛋白互作
RIP WB检测：
图1 western blot蛋白检测
Fig.1western blot Protein detection
Lane M：PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准（从上到下：250,130,100,70,55,35,25,15,10）
Lane 1：IP
Lane 2：IgG
Lane 3：Input
RIP WB检测：
图2 western blot蛋白检测
Fig.2western blot Protein detection
Lane M：PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准（从上到下：250,130,100,70,55,35,25,15,10）
Lane 1：IP
Lane 2：IgG
Lane 3：Input