杂交瘤的建系流程

    在制备单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量，可以选择其中20个最佳的候选孔。在检测这20个孔的培养上清为阳性后，应该将这些孔的细胞进行冻存，同时进行有限稀释。本文介绍了杂交瘤建系实验过程中所需要的实验材料以及具体的实验步骤。

材料

材料及仪器
生长的杂交瘤	克隆和扩增用培养基
24孔板	4ml有盖试管，无菌

1.当96孔板中生长的杂交瘤长到25%~50%汇合时(主要孔)，用无菌的移液器(调节为100μl的微量移液器)将主要孔中的细胞重悬，并将孔中全部内容物转入24孔板的一个孔，保证有足量的细胞在此扩增孔中扩增。若是从一个长有成纤维细胞的孔中转移细胞，应该尽早进行转移操作，以免成纤维细胞过度生长，并且操作时切忌刮到孔底(这样做会松动成纤维细胞)。

两个小鼠或仓鼠，或一个大鼠的脾即可满足细胞融合的需要。

2.用1ml移液器在主要孔中滴人3滴添加10mmol/LHEPES和1mmol/L丙酮酸钠的DMEM-20完全培养液，放回CO2培养箱培养。

3.用干净的移液器取1~1.5ml用于克隆和扩增的培养基加人24孔板，CO₂培养箱培养2~3d。主要孔与扩增孔要用不同的移液器从不同的试剂瓶中取用培养基。

4.当24孔板中的细胞长到25%~50%汇合时(2~3d)，用有限稀释技术进行克隆操作。而当主要孔中的细胞长到25%~50%汇合时，必要时可重复步骤1~3。

5.完成有限稀释操作之后，将24孔板中多余的细胞移入4ml无菌有盖试管中。用添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20完全培养液继续培养24孔板中的细胞。

6.将前述4ml管于室温，500g 离心5min。将上清保留以备进一步抗体鉴定或作为对照。冻存细胞沉淀(附录3B)。如果已确定建立了稳定的细胞克隆，那么细胞建系就完成了，将其冻存，并确保可被顺利复苏。

7.如果有限稀释操作不能培养出有抗体分泌活性的细胞系，则复苏那些之前从24孔板中分离的细胞。将其重新在24孔板中培养，过夜，并用这些细胞重新建立有限稀释孔板。将其冻存并妥善保存。

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