细胞融合与杂交瘤分选步骤

    细胞融合与杂交瘤分选是单克隆抗体制备过程中重要的步骤，本文介绍了细胞融合与杂交瘤分选实验过程中所需要的实验材料以及具体的实验步骤由于在细胞融合后可对目标单克隆抗体进行检测的次数是有限的，在细胞融合前必须检查条件培养液以排除筛选时可能出现的人为因素影响。

材料及仪器

材料及仪器
SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞系(药物标记的非分泌型; ATCC	添加10mmol/L HEPES和1mmol/L丙酮酸钠的DMEM 10和DMEM-20完全培养基	免疫的实验动物:小鼠、大鼠或仓鼠
50% (m/V) PEG溶液，无菌	DMEM完全培养基，未添加血清	氯化铵溶液: 0. 02mol/L Tris•Cl, pH7.2/ 0. 14mol/L NH4Cl
添加10mmol/L HEPES、1mmol/L 丙酮酸钠、1XHAT或1X HT的DMEM-20完全培养基	175cm2组织培养用细颈瓶	倒置显微镜
400ml和600ml烧杯(各3只)	100mm有盖培养皿	尖头镊和解剖剪
细网金属筛	50ml塑料锥底离心管，无菌	Beckman离心机和TH-4转子或同等设备
96孔平底微量滴定板	1ml和10ml移液管

1.细胞融合前一周，开始在添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-10完全培养基中培养 SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞系(融合用细胞)。在细胞融合操作前骨髓瘤细胞对于不同的实验动物应达到以下水平(每个175cm²培养瓶含培养液100ml):小鼠，1X 10⁸个细胞/瓶，2或3瓶;仓鼠，2X10⁸个细胞/瓶，3或4瓶;大鼠，5X10⁸-1X 10⁹个细胞/瓶，10瓶。

两个小鼠或仓鼠，或一个大鼠的脾即可满足细胞融合的需要。

2.细胞融合前3d,进行二次免疫。

3.细胞融合前1d,转移SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞至新鲜的添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-10完全培养基中。

4.在细胞融合前，用倒置显微镜确定SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞生长良好(折光力强，未固缩)，未污染(没有明显的细菌或真菌迹象)，并且生长足量。如果骨髓瘤细胞不符合这些要求则暂不进行细胞融合。

5.将以下物品于37C预热:
3个400ml以及3个600ml烧杯，每个烧杯内盛100ml水;20ml无菌的未加血清的DMEM完全培养液;5ml无菌的50% PEG溶液。

6.处死二次免疫的实验动物。不要用麻醉法处死动物。对于小鼠，应用颈椎脱白法，对于大鼠和仓鼠应用二氧化碳窒息法，取脾脏。

7.将脾脏移至预置了10ml无菌的未加血清的DMEM完全培养液的100mm培养皿中。以下操作要求在层流罩中超净工作台完成。

8.使用尖头镊压碾或解剖剪将脾组织剪碎，移去组织碎片并通过细网金属筛进一步分离细胞，制成单细胞悬液。

9.将脾细胞悬液移至已消毒的50ml塑料锥底离心管，并用无血清DMEM完全培养液加满离心管(不要使用含有蛋白质或HEPES的培养液)。室温下，TH-4离心机中500g离心5min,弃上清。

10.在5ml氯化铵溶液中将细胞沉淀重悬以裂解红细胞。在室温下静置5min,加人45ml无血清DMEM完全培养液，如步骤9进行离心。

11.加人50ml无血清DMEM完全培养液，将沉淀重悬，并再次离心。重复添加 DMEM和离心1次，以完成2次洗涤。

12.在洗涤脾细胞的同时，将SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞移人50ml塑料锥底离心管。如步骤9进行离心，分离细胞。在DMEM中重悬细胞，如步骤11洗涤骨髓瘤细胞3次。

13.分别在10ml无血清DMEM完全培养液中重悬脾细胞和骨髓瘤细胞。用细胞计数器和台盼蓝拒染试验对两种细胞悬液进行细胞计数和活力测定。此时两种细胞悬液应该都具有100%的细胞活力。

14.在细胞计数的基础上，以约2.5X106个总细胞数/ml计算培养细胞所需添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20培养基的量。37℃水浴预热此培养基。取96孔平底微量滴定板做好标签备用，每10ml细胞悬液需准备-一个孔板。

15.将SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞与脾细胞以1:1 (V/V) 的比例在50ml塑料锥底离心管中混合。以无血清DMEM完全培养液加满离心管。室温下，500g 离心5min。

16.在进行细胞离心的同时，在层流罩中准备三个600ml烧杯，内盛75-100ml37%C温水，再将3个内盛100ml37℃温水的400ml烧杯分别放人600ml烧杯中，形成水浴环境。将预热的50%PEG溶液试管与无血清DMEM完全培养液试管(步骤5)分别放入2个37℃水浴中。

17.吸取并丢弃混合细胞离心的上清部分(步骤15)，并将离心管置于第三个水浴烧杯中。使用1ml移液器向混合细胞沉淀中加入1ml预热的50%PEG,在1min内匀速逐滴缓慢加人，每加入一滴即用移液器轻轻搅匀细胞。滴加完成后轻轻搅匀1nin。

18.使用干净的移液管向混合细胞液中逐滴加人预热的无血清DMEM完全培养液，加人的同时轻轻搅匀:
1min内匀速滴加1ml DMEM;1min内匀速滴加1ml DMEM;
2-3min内勾速滴加7ml DMEM (使用10ml移液管)。
注意，此时应有肉眼可见的细胞团漂浮。室温下，500g 离心5min。

19.在进行细胞离心的同时，将水浴烧杯重新加热到37℃并放人层流罩。将预热的添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM 10完全培养基放入水浴。

20.弃上清(步骤18)，将试管放入水浴。用干净的10ml移液管将预热的添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-10完全培养基用力吹人细胞沉淀。连续添加，直到将所有培养基加人步骤14准备的培养基。如果培养基体积超过了50ml,小心地吸取多余量转人其他无菌容器，如培养瓶。如果必要，可用移液管头压碎细胞团。此后，不需继续保持细胞悬液于恒温水浴中。

21.小心地用10ml移液管吸取10ml细胞悬液(不要使用粗糙的或重复使用的移液管)。小心地在96孔平底微量滴定板的每个孔中滴加2滴(100~125pl) 细胞悬液。所有细胞悬液滴加完后，用支干净的移液管除去过多的细胞悬液。37℃过夜培养。

为了最大程度地减少成纤维细胞的过度生长，可加入一个可选步骤:在移种到96孔板之前，可以将完成融合的细胞悬液在培养瓶中培养过夜，以除去贴壁生长的成纤维细胞。

22.培养一天后， 在倒置显微镜下检查细胞生长情况。移种了合适数量细胞的孔底部将出现成片的单层高活力细胞或细胞团。

23.用10ml移液管在每个孔中滴加2滴添加HEPES、丙酮酸钠和HAT的DMEM-20完全培养基混合液。每块孔板需更换不同的移液管头，并保证板盖不被互换，之后将孔板置于培养箱。

24.如果孔板发生污染，将其丢弃。或者，如果污染仅限制在1或2个孔中，按以下步骤操作:用消毒的巴氏滴管吸取受污染的孔内容物，移入空培养瓶。用70%乙醇漂洗这些孔，并用已消毒棉签擦拭。重复洗涤2次。用蘸有70%乙醇的棉签擦拭周围。当有其他孔板在层流罩中时，不要打开受污染的孔板。

25.于培养的第2、3、4、5、7、9、11天，用已消毒的小号巴氏滴管吸取每个孔的一半培养液，移人空培养瓶。操作时将滴管保持45°倾斜，贴近培养上清的表面吸取。每个孔板需使用不同的滴管。加入添加HEPES、丙酮酸钠和HAT的DMEM-20完全培养基混合液(步骤23)，放回孵箱。如果在第2天和第3天没有发现明显的细胞死亡迹象，用加有HAT的培养液培养部分原骨髓瘤细胞，以检测两者的质量。

26.培养4d后，根据孔中的实际细胞数量、融合效率和杂交瘤的外观及生长情况来决定是否更换培养基。避免孔中液体变成黄色(酸性) 并持续1d以上。即使不需要更换培养液也应每天检查孔板，并在出现酸性迹象前更换培养液。

27.培养第14天，改用添加HEPES、丙酮酸钠和HT的DMEM20完全培养液培养细胞，放回培养箱培养。

28.培养第15天直至最后，改用不添加HAT或HT的含有HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20完全培养液。当大多数孔内细胞生长到占孔底面积的10% ~25%时，可以进行杂交瘤筛选。对于生长特别稠密的孔，可以在换液后2d,培养液变黄时进行细胞筛选(一般情况下，小鼠-小鼠细胞或大鼠-小鼠细胞融合后需10~14d,仓鼠-小鼠细胞融合后需14~21d)。

如果在筛选检测中需用³H-胸腺嘧啶核苷摄入试验，至少需要更换3或4次不添加HAT或HT的含有HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20完全培养液，稀释残留的胸腺嘧啶核苷以不影响之后的标记。

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