有限稀释克隆法

    有限稀释克隆法常用来进行杂交瘤细胞克隆化培养，本文介绍了有限稀释克隆法的相关内容，包括有限稀释法实验所需要的材料仪器、实验具体操作以及注意事项。

材料

材料及仪器
候选杂交瘤系	50%（m/V）PEG溶液，无菌
克隆和扩增用培养基	氯化铵溶液
倒置显微镜	微孔板观察镜
400ml和600ml烧杯（各三只）	96孔平底微量滴定板
1ml和10ml微量滴定板

1.重悬候选杂交瘤所在孔中的细胞，用血细胞计数器和台盼蓝拒染试验对一部分（50μl)细胞进行计数和细胞活力测试。

2.以每毫升50个活细胞和每毫升5个活细胞的量分別准备10ml含有克隆和扩增用培养基的细胞悬液（根据需要多次稀释）。将细胞悬液移种至96孔板，每个孔200 μl (最终每孔分别为10个细胞和1个细胞）。 CO₂培养箱中培养7〜10d。

3.观察出现杂交瘤生长的孔数，以确定单克隆生长最佳的稀释度。把孔板举高肉眼观察或使用微孔板观察镜对杂交瘤进行观察。

4.在继续细胞培养之前，用倒置显微镜观察单克降细胞。单一的致密细胞集落是单克隆细胞增殖的典型特征，而多克隆细胞增殖往往出现多个细胞集落，尽可能不要使用多克隆细胞生长的孔。

5.应用与筛选主要孔细胞相同的方法检测培养7-14d的单克隆细胞分泌目标抗体的活性（对于小鼠-小鼠杂交瘤应于第7天；所有的孔都应该在其颜色变黄时进行检测）。使用部分原杂交瘤的培养上清作为阳性对照。

6.如果已经确定得到了所需的细胞克隆，按与原杂交瘤相同的方法扩增并冻存这个细胞克隆。

7.按步骤1和2再次克隆阳性杂交瘤克隆，配制含有60个活细胞的40ml克隆用培养基（最终为0.3个细胞/孔），重复步骤4-6。

8.连续3天，每天以1：2的比例将再次克隆的细胞转入DMEM-10完全/HEPES/丙酮酸钠培养液，以使所需的杂交瘤成为稳定的细胞系。

注意事项：一株偶然克隆的杂交瘤会无法适应DMEM-10完全/HEPES/丙酮酸钠培养液的环境，并要求较高浓度的FCS。因此，在转入DMEM-10培养基之前先将细胞转入DMEM-15培养基。在此过程中应谨防支原体污染。

9.在不同天数冻存多个装有细胞的小瓶（含各不相同量的冻存用培养基）。复苏样品瓶，以适当方法检测细胞生长活性和培养上清中单克隆抗体（MAb）的活性。应用杂交瘤大规模制备腹水和培养上清。检测单抗的同种型。

注意事项：即使是再次克隆的杂交瘤也会具有不稳定性，尤其是某些仓鼠-小鼠杂交瘤。这样的杂交瘤需要进行克隆。长时间的体外培养可能导致MAb的不分泌。为了减少这一问题带来的影响，将部分已知可以生产Mab的细胞冻存起来是必要的，同时这些细胞将来也可以作为活性细胞的来源。

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