特异性识别磷酸化位点的抗体，是如何制备的？

你正在研究一个崭新的信号通路，文献稀少，你兴奋地设计好实验，却在第一步就卡住了——市面上根本找不到能识别你目标蛋白特定磷酸化位点的抗体。这是许多探索前沿领域的科研人真实的困境。

当通用工具无法满足独特需求，定制便成为破局之道。

以多克隆抗体制备为例，常规抗体制备的流程一般分为抗原设计、抗原制备、免疫动物、收获抗体等步骤。

而磷酸化抗体的制备，其核心在于必须先人工合成“磷酸化多肽”作为抗原，流程自此分岔，并由此带来了三大独特难点：

（1）化学需要合成带磷酸化修饰的多肽作为抗原，这一步本身就很棘手。
（2）免疫动物产生的抗血清是一个混合物，包含我们想要的（只识别磷酸化形式）、不想要的（只识别非磷酸化形式）以及两种都识别的抗体。因此，必须通过复杂的亲和纯化流程才能“淘洗”出高特异性的抗体。
（3）必须通过严谨的实验证明，该抗体只与磷酸化蛋白反应，不与未修饰的蛋白或其他蛋白交叉反应。

下面我们以案例为基础，展示一下磷酸化抗体的制备流程。

1、实验设计

（1） 以目的序列设计免疫用多肽序列，合成非磷酸化多肽和磷酸化多肽，多肽偶联KLH；
（2） 磷酸化多肽免疫2只rabbit；
（3） 磷酸化多克隆抗体纯化

2、多肽合成

2.1、非磷酸化多肽HPLC检测结果

Sequence:	XXXXXXXXXXXX-C
Column:	4.6mm*250mm, GS-120-5-C18-BIO
Calculation Type:	Percent
Solvent A:	0.1% Trifluoroacetic in 100% Acetonitrile
Solvent B:	0.1% Trifluoroacetic in 100% water
Gradient:	A	B
	0.00min 20%	80%
	25min  45%	55%
	25.1min 100%	0%
	30min  stop

2.2、非磷酸化多肽MS分析结果

MW:	1380.59	Probe bias:	-3.5kv
Probe:	ESI	Detector:	1.0kv
DL:	-20.0v	T.Flow:	0.2ml/min
DL Temp:	250℃	B.conc:	50%H2O/50%ACN
Block Temp:	200℃

2.3、磷酸化多肽HPLC分析结果

2.4、磷酸化多肽MS检测结果

MW:	1460.57	Probe bias:	-3.5kv
Probe:	ESI	Detector:	1.0kv
DL:	-20.0v	T.Flow:	0.2ml/min
DL Temp:	250℃	B.conc:	50%H2O/50%ACN
Block Temp:	200℃

3.纯化抗体效价检测

起始稀释度: 1:500
效价即样品OD/空白OD ≥2.1的最高稀释度
通过ELISA检测结果得出，磷酸化多肽抗体针对磷酸化多肽A效价在512K左右，针对非磷酸化多肽B效价在512K左右。

起始稀释度: 1:500
效价即样品OD/空白OD ≥2.1的最高稀释度
通过ELISA检测结果得出，去除交叉反应的磷酸化多肽抗体针对磷酸化多肽A效价在512K左右，针对非磷酸化多肽B效价在4K左右。

起始稀释度: 1:500
效价即样品OD/空白OD ≥2.1的最高稀释度
通过ELISA检测结果得出，非磷酸化多肽B抗体针对磷酸化多肽A、非磷酸化多肽B效价均在256K左右。

4.纯化后抗体纯度检测

5.结论

通过ELISA检测效价得出，磷酸化多肽抗体针对磷酸化多肽A效价在512K左右，针对非磷酸化多肽B效价在4K左右，纯度在85%以上，获得磷酸化抗体得率达到3.5 mg以上。

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