烟草叶片瞬时表达，是植物分子农业中最灵活、最快速的重组蛋白生产平台之一。利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。本文整理了实验所需的材料、操作步骤、注意事项，并补充了近年来在 p19 共表达、载体优化和环境调控等方面的最新进展。
- 实验原理与所需材料
- 烟草瞬时表达工作流总览
- 操作步骤：从农杆菌活化到叶片注射
- 实验条件速查卡片
- 注意事项与常见问题
- p19 共表达与表达量提升策略
- 表达时间曲线与最佳取样时间
- 常见问题解答（FAQ）
原理：利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。烟草瞬时表达系统已成为分子农业领域快速制备治疗性抗体、疫苗及重组药用蛋白等生物制品的重要技术平台，具有病原体污染风险低、生产成本低、易于规模化生产等显著优势。
- 0.5 M MES（pH 5.6）
- 10 mM MgCl₂
- 100 mM 乙酰丁香酮（acetosyringone, AS）
- 一次性注射器（无针头）
- 恒温摇床
- 分光光度计
24小时
至OD600=1.0
静置3小时
标记区域
取样检测
BiFC/纯化
挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆（菌株：EHA105）于 1ml 含有相应抗生素的 LB 中，28℃ 摇床 250rpm 培养 24 小时。
于 5ml 含有相应抗生素的 LB 中，加入 100μl 0.5 M MES、2μl 100mM AS，再接种 50μl 农杆菌菌液，28℃ 摇床 250rpm 培养至 OD₆₀₀=1.0（大约 12-18 小时）。
4000rpm 常温离心 10 分钟收集菌体，用 10mM MgCl₂ 重悬至 OD₆₀₀=1.0，以每毫升菌液加入 2μl 的比例加入 100mM AS，静置 3 小时以上。
取正处于生长旺盛时期（一个月左右，未开花）的本生烟草（Nicotiana benthamiana），用注射器吸入菌液，去掉针头，以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的反面渗透进去。若注射不顺畅，可用针头在叶片上制造一个微小的伤口，再将菌液从伤口注入。
正常条件下放置，24-48 小时即可取样。
菌液浓度参考：最新优化研究显示，农杆菌菌液 OD₆₀₀ 为 0.8~1.0 并与含有 p19 基因的载体共注射条件下，注射 3~5 天后本氏烟草叶片表现出很强的荧光信号，实现了高效瞬时表达。
生长旺盛期
有的文献报道烟草注射前需黑暗处理，有的文献则报道需要持续光照处理。个人经验至少对于蛋白表达这一操作来说不需要任何处理，正常条件生长即可。但是用于蛋白互作（BiFC）可能需要特定的条件，可参见 BiFC 部分。最新综述指出，环境参数（温度、湿度、光照等）对表达效率有显著影响，可根据具体实验需求进行调控。
表达载体的启动子一般是 35S。若需要特异基因自身的启动子驱动，需考虑水稻与烟草的单/双子叶植物的区别造成的差异。
一般情况下，转化后 24 小时即有蛋白表达，而 48 小时后会渐渐消失。若要获得更高的表达量，推荐使用 p19 共注射，表达时间可延长至 3-7 天。近期研究还发现，对于某些重组蛋白（如猴痘病毒 B6R-Fer），最佳表达时间可达 12-14 天，最终纯化蛋白浓度约 1 mg/mL，产量约 0.85 mg/kg 鲜重。
如果要抽提并纯化蛋白，在未用 p19 的情况下需 5-10g 烟草叶片，加 p19 的情况下可以减半。
p19 蛋白来源于番茄丛矮病毒，可抑制宿主对外源基因的 RNA 沉默效应，提高异源基因转录本的稳定性，进而促进异源蛋白的表达，广泛应用于转基因植物及烟草叶片、拟南芥叶片、番茄叶片或原生质体的瞬时表达系统中。
表达时间：24-48小时
纯化需叶片：5-10g
表达时间：3-7天
纯化需叶片：减半
操作方法：若需要提高外源蛋白的表达，可用同样的方法制备含有番茄丛矮病毒基因 p19 超表达载体的农杆菌，与目的基因的农杆菌等量混合后再注射烟草。
实验数据显示，仅 P19 共表达的样本较空白对照，蛋白积累量提升 2-3 倍。农杆菌携带的 P19 蛋白通过阻断植物 RNA 沉默系统，使目标基因在细胞质中稳定表达。ELISA 结果显示，使用 p19 的 tPA 表达水平达到 10 mg/g 叶片鲜重，约为不含 p19 载体的农杆菌注射叶片的 2 倍。
其他提升策略（最新进展）：
- 载体最小化：通过去除载体中非必需序列实现载体最小化，可将 GUS 和 ASM 的 mRNA 表达水平分别提高 2.02 倍和 2.05 倍，蛋白水平分别提高 1.76 倍和 1.75 倍。
- 浸润缓冲液优化：优化浸润缓冲液组成，联合 p19 共表达、乙酰丁香酮和抗坏血酸，可进一步显著提升蛋白表达量。
- 宿主基因沉默策略：研究表明，沉默烟草免疫相关基因（如 CORE）可使 GFP 产量提高 8 倍。
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