烟草叶片瞬时表达，是植物分子农业中最灵活、最快速的重组蛋白生产平台之一。利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。本文整理了实验所需的材料、操作步骤、注意事项，并补充了近年来在p19共表达、载体优化和环境调控等方面的最新进展。
- 实验原理与所需材料
- 操作步骤：从农杆菌活化到叶片注射
- 注意事项与常见问题
- p19共表达与表达量提升策略
- 最新优化进展：载体最小化与环境调控
- 常见问题解答（FAQ）
原理：利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。烟草瞬时表达系统已成为分子农业领域快速制备治疗性抗体、疫苗及重组药用蛋白等生物制品的重要技术平台，具有病原体污染风险低、生产成本低、易于规模化生产等显著优势。
试剂：
- 0.5 M MES（pH 5.6）
- 10 mM MgCl₂
- 100 mM 乙酰丁香酮（acetosyringone, AS）
仪器：
- 一次性注射器（无针头）
- 恒温摇床
- 分光光度计
挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆（菌株：EHA105）于 1 ml 含有相应抗生素的 LB 中，28℃ 摇床 250 rpm 培养 24 小时。
于 5 ml 含有相应抗生素的 LB 中，加入 100 μl 0.5 M MES、2 μl 100 mM AS，再接种 50 μl 农杆菌菌液，28℃ 摇床 250 rpm 培养至 OD₆₀₀=1.0（大约 12-18 小时）。
4000 rpm 常温离心 10 分钟收集菌体，用 10 mM MgCl₂ 重悬至 OD₆₀₀=1.0，以每毫升菌液加入 2 μl 的比例加入 100 mM AS，静置 3 小时以上。
取正处于生长旺盛时期（一个月左右，未开花）的本生烟草（Nicotiana benthamiana），用注射器吸入菌液，去掉针头，以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的反面渗透进去。若注射不顺畅，可用针头在叶片上制造一个微小的伤口，再将菌液从伤口注入。
正常条件下放置，24-48 小时即可取样。
有的文献报道烟草注射前需黑暗处理，有的文献则报道需要持续光照处理。个人经验至少对于蛋白表达这一操作来说不需要任何处理，正常条件生长即可。但是用于蛋白互作（BiFC）可能需要特定的条件，可参见 BiFC 部分。最新综述指出，环境参数（温度、湿度、光照等）对表达效率有显著影响，可根据具体实验需求进行调控。
表达载体的启动子一般是 35S。若需要特异基因自身的启动子驱动，需考虑水稻与烟草的单/双子叶植物的区别造成的差异。
一般情况下，转化后 24 小时即有蛋白表达，而 48 小时后会渐渐消失。若要获得更高的表达量，推荐使用 p19 共注射，表达时间可延长至 3-7 天。近期研究还发现，对于某些重组蛋白（如猴痘病毒 B6R-Fer），最佳表达时间可达 12-14 天，最终纯化蛋白浓度约 1 mg/mL，产量约 0.85 mg/kg 鲜重。
如果要抽提并纯化蛋白，在未用 p19 的情况下需 5-10 g 烟草叶片，加 p19 的情况下可以减半。
p19 蛋白来源于番茄丛矮病毒，可抑制宿主对外源基因的 RNA 沉默效应，提高异源基因转录本的稳定性，进而促进异源蛋白的表达，广泛应用于转基因植物及烟草叶片、拟南芥叶片、番茄叶片或原生质体的瞬时表达系统中。
操作方法：若需要提高外源蛋白的表达，可用同样的方法制备含有番茄丛矮病毒基因 p19 超表达载体的农杆菌，与目的基因的农杆菌等量混合后再注射烟草。
实验数据显示，仅 P19 共表达的样本较空白对照，蛋白积累量提升 2-3 倍。农杆菌携带的 P19 蛋白通过阻断植物 RNA 沉默系统，使目标基因在细胞质中稳定表达。ELISA 结果显示，使用 p19 的 tPA 表达水平达到 10 mg/g 叶片鲜重，约为不含 p19 载体的农杆菌注射叶片的 2 倍。
注意事项：p19 共注射方法只适用于本生烟草。使用 p19 后，蛋白表达时间为注射后 3-7 天，且可以大幅提高表达量。
其他提升策略（最新进展）：
- 载体最小化：通过去除载体中非必需序列实现载体最小化，可将 GUS 和 ASM 的 mRNA 表达水平分别提高 2.02 倍和 2.05 倍，蛋白水平分别提高 1.76 倍和 1.75 倍。
- 浸润缓冲液优化：优化浸润缓冲液组成，联合 p19 共表达、乙酰丁香酮和抗坏血酸，可进一步显著提升蛋白表达量。
- 宿主基因沉默策略：研究表明，沉默烟草免疫相关基因（如 CORE）可使 GFP 产量提高 8 倍。
近年来，烟草瞬时表达系统的优化研究取得了多项重要进展，从载体设计、环境调控到宿主改造等多个维度提升了蛋白表达效率。
研究者通过系统性地去除 pBI121 载体中的非必需序列，构建了 pBI121Δlac 和 mpBI121 载体。使用 GUS 和 ASM 作为模型蛋白，发现载体最小化显著提高了 mRNA 和蛋白表达水平。mpBI121 骨架使 GUS 和 ASM 的 mRNA 表达水平分别提高 2.02 倍和 2.05 倍，蛋白水平分别提高 1.76 倍和 1.75 倍。
研究者发现，沉默烟草免疫相关基因可以显著提高瞬时蛋白表达水平。沉默冷休克蛋白受体（CORE）可使 GFP 产量在 6-8 周龄的较老植株中提高 8 倍。此外，沉默 CERK1、EIN2、NPR1 等免疫信号通路组分也显示出提升蛋白积累的效果。
最新综述系统总结了环境因子与培养条件对本氏烟草重组蛋白产量的影响，重点关注配备人工光照的植物工厂等受控环境栽培系统。温度、湿度、光照等参数的优化可显著影响表达效率。
基于马铃薯 X 病毒（PVX）的载体通过整合异源 RNA 沉默抑制因子（VSRs），如 P19，可进一步改进瞬时表达效率。
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