规模化纯化蛋白质的关键因素在于产量和成本，纯化过程应尽可能精简，避免人为因素干扰。进行规模化纯化蛋白质时，已经基本了解目的蛋白、原料、生产方法、产品纯度要求和最终数量等，但是纯化过程中很多方面可能要重新评估并作出适当的改变。
从实验室规模纯化蛋白质向工业化规模纯化生产蛋白质的扩大，属于工程学的范畴。工厂规模是一次性的，它必须成功。
本文内容速览：
- 一、基本原则（四大原则）
- 二、主要操作过程
- 三、细胞破碎方法对比速查表
- 四、色谱分离放大要点
- 五、规模化纯化全流程速查表
- 六、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、基本原则
钟鼎生物实验室实拍
规模化纯化蛋白质需要遵循以下四大基本原则：
- 合理设计实验方案 在规模化纯化蛋白质过程中，主要步骤通常不超过4～5个。要尽可能多地了解目的蛋白和杂质的物化性质，尽可能早使用高选择性的步骤，尽可能早分离除去数量最多的杂质；在分离纯化的早期一般是浓缩蛋白质并除去水；最后执行特别费时间或成本很高的步骤。
- 选择适当的发酵系统和发酵条件 发酵过程和蛋白质分离纯化过程是相互影响的，合适的发酵将有助于发酵产品的分离及蛋白质的纯化。要严格控制、防止蛋白酶和细菌的污染。
- 保持蛋白质活性，减少变性及失活 选择适当的操作温度（尽量在低温下进行操作）、pH和泵，可以有效地控制蛋白质的变性。为了避免因为肽酶的作用等因素造成蛋白质降解，要保持比较低的浓度，尽量缩短操作时间。随着规模的扩大，样品溶液浓度要逐步递增，以减少对色谱过程的影响。
- 保持清洁和卫生 即使是低水平的微生物污染也会造成很大的麻烦：过滤机、色谱柱寿命的缩短，产品稳定性的降低等。因此，所有设备都要定期进行严格的清洁和卫生工作。
PART 02二、主要操作过程
工业用离心机通常设计成连续进料。细胞在离心机中沉淀越快，在转子中的保留时间就越短，相应地，离心处理量越大。决定离心机容量的一个主要因素是相关粒子的大小。
通过离心操作回收酵母已有很多年，而动物细胞的处理更加复杂，因为它们很容易破裂，当通过离心系统时，可能会分解产生微小的碎片。大规模分离细菌和细胞碎片最常用的离心机是多层转盘离心机。
过滤技术（深层过滤，微孔过滤，超滤）常用于固液分离。旋转式真空过滤机是比较常见的一种，已应用于大规模生产酶制剂过程，从发酵液中除去细菌菌体或丝状微生物。膜过滤系统越来越多应用于规模化从发酵液中分离细胞和细胞碎片，在无菌分离的效果方面远好于价格昂贵的离心机。然而，膜过滤的主要缺点是不能处理高浓度细胞，高浓度细胞会明显降低过滤速度。微滤能够截留溶液中非蛋白质的微小物质，而超滤能够截留溶液中的蛋白质。
对于细胞内蛋白质的分离，需要先有效破碎细胞。通常先收集细胞，然后进行洗涤以除去残留的培养基。对于仅仅由细胞膜包围着的细胞，比如哺乳动物细胞，破碎比较容易；如果存在聚合细胞壁结构（比如微生物细胞），破碎时就会困难些。
早期纯化阶段需要将蛋白质溶液浓缩 10～50倍，以减小过程体积并使随后的操作更容易处理。这在规模化纯化蛋白质时是个重要的必不可少的步骤。超滤是比较合适的技术，一般采用错流系统。
采用色谱技术从粗产品中分离纯化蛋白质，在生产中始终都要慎重操作。经过浓缩后，得到了蛋白质、其他成分（比如类脂物、细胞壁或其他多糖类）、盐和水的混合液，随后一般经 2～4步色谱纯化才能达到所要求的蛋白质纯度。
速查三、细胞破碎方法对比速查表
以下是三种规模化破碎细胞方法的比较：
| 方法 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|
| 均质法 | 产量可达 6000 L/h | 不适用于高等真菌；产热高容易使蛋白变性；容易污染 |
| 研磨法 | 产量可达 2000 L/h；适用于细菌与酵母细胞 | 破碎效率不稳定；容易污染 |
| 酶解法 | 条件温和，损失较少 | 条件摸索复杂，成本较高 |
方法选择建议：大规模细菌破碎首选均质法（产量高），酵母和部分细菌可考虑研磨法，对剪切力敏感或需保持高活性的蛋白可考虑酶解法。三种方法各有权衡，需根据细胞类型、目标蛋白性质和生产规模综合选择。
PART 04四、色谱分离放大要点
在设计规模化色谱操作时，要保证色谱过程可以重复、安全性好、能满足卫生要求，色谱操作过程、设备、环境、厂房的设计也能保障整个操作环节的卫生要求及安全性，同时方便于色谱过程数据的收集。通常需要综合考虑以下几个因素：
- 操作过程和装置的控制及可靠性
- 卫生条件的维持
- 固定投资费用及操作成本
4.1 分批分离策略
在大规模色谱分离时，由于样品的体积很大，加样时间常常很长，成为分离过程的限制性因素。此时往往可以采用分批分离的方法，即吸附过程甚至吸附和解吸过程都不在色谱柱中进行，样品在容器中与离子交换剂充分混合完成吸附，将上清液除去，然后将吸附了蛋白质的离子交换剂装柱并进行洗脱，或者直接在容器中用阶段洗脱的方法进行洗脱。此方法可以大大提高分离速度，当然也会使分辨率变低，适合在规模化分离的前期使用。
4.2 离子交换的规模化应用
离子交换因其具有很高的样品吸附容量，不但在实验室分离中广泛被使用，而且适合于规模化的蛋白质纯化。离子交换剂具有从稀溶液中浓缩蛋白质的能力，也适合于从大体积的样品（如发酵液）中纯化所需蛋白质。
对于实验室小规模的制备，体积为 500 mL 的色谱柱基本能够满足需要；而在工业化应用中，色谱柱的体积可以被放大到 100～200 L。由于分离的原理和过程是一致的，很明显，根据已经优化好的小规模分离条件，结合放大时的容量因子，可以推测出大规模分离时所需的操作条件。
4.3 放大原则
核心原则：保持色谱操作上样、吸附和洗脱的条件不变，包括：
- 样品的组成
- 离子交换剂的种类
- 样品介质比（mg 蛋白/mL 离子交换剂）
- 起始和洗脱缓冲液的组成
- pH 和离子强度
在此基础上根据样品量放大柱体积、洗脱剂体积、流速等参数。
| 参数 | 放大规则 |
|---|---|
| 柱体积 | 随样品体积的增大而线性增大；主要通过选用内径大的色谱柱来实现 |
| 柱高 | 一般不宜有太大的增加，否则会造成分离时间的增加和样品峰宽的加大 |
| 洗脱剂体积 | 无论采用哪种洗脱方法，都随样品体积增加而增加 |
| 线性流速（cm/h） | 放大过程中应保持线性流速不变 |
| 体积流速（mL/min） | 随色谱柱截面积的增大而增加 |
换算关系：体积流速（mL/min）＝ 线性流速（cm/h）× 色谱柱截面积（cm²）／ 60
4.4 大规模分离的注意事项
- 样品波动：通过发酵、动植物细胞培养或从生物原料提取目的蛋白时，每一批次的样品在组成、总蛋白含量、目的蛋白所占比例等方面总有波动，会造成色谱柱内实际吸附的蛋白数量和组成每次都有所不同。
- 交换容量留余地：大规模分离时样品介质比往往较大，离子交换剂的交换容量已被利用到很高的程度，放大过程中在有效交换容量上应留有一定余地。
- 介质稳定性：大规模分离中使用的离子交换剂应当具有良好的物理和化学稳定性，基质颗粒通常不宜太小；颗粒直径分布均匀有利于保持相对较低的背景压力。
- 成本考量：由于大规模分离时交换剂用量很大，必须考虑介质的成本。
- 液流分配器：大规模分离中采用直径很大的色谱柱，需在柱床的上方设计一个液流分配器，以便采用多口注入方式，保证液流能均匀进入柱床。
- 上样前处理：上样前必须保证样品溶液和起始缓冲液在pH和离子强度方面保持完全一致。体积很大的样品可通过稀释使其与起始缓冲液离子强度一致，再用酸碱调节pH一致。
4.5 FPLC——规模化色谱的新选择
新发展起来的适用于规模化的是快速蛋白质液相色谱（FPLC）。FPLC在中等压力条件下工作，比传统色谱分离速度更快，分离效果更好。FPLC在实验室中被广泛接受，在中试和大规模蛋白质纯化中也显示出了强大的潜力。相比于高压系统（如HPLC），它的一个优点就是其设备用塑料而非不锈钢制成，可耐任何缓冲液，因而适于分离纯化蛋白质。
速查五、规模化纯化全流程速查表
| 阶段 | 关键操作 | 关键参数 / 要点 |
|---|---|---|
| 方案设计 | 合理设计纯化步骤 | 主要步骤不超过 4～5 个；高选择性步骤前置 |
| 发酵条件 | 选择适当发酵系统与条件 | 防止蛋白酶和细菌污染 |
| 活性保持 | 低温操作、控制pH、缩短时间 | 样品溶液浓度随规模逐步递增 |
| 清洁卫生 | 设备定期清洁消毒 | 避免低水平微生物污染 |
| 细胞分离 | 连续进料离心 / 膜过滤 | 多层转盘离心机；微滤截留非蛋白物、超滤截留蛋白 |
| 细胞破碎 | 均质法 / 研磨法 / 酶解法 | 均质法6000 L/h；研磨法2000 L/h；酶解法条件温和 |
| 浓缩 | 超滤（错流系统） | 浓缩 10～50 倍 |
| 色谱分离 | 2～4步色谱纯化 | 吸附/双水相/盐析 → 离子交换/亲和 → 高纯度精制 |
| 色谱放大 | 柱体积线性放大 | 保持线性流速不变；柱高不宜增加太多 |
| FPLC | 中压快速液相色谱 | 塑料设备耐任何缓冲液；分离速度更快 |
FAQ六、常见问题解答
Q1：规模化蛋白质纯化的关键因素是什么？
规模化纯化蛋白质的关键因素在于产量和成本，纯化过程应尽可能精简，避免人为因素干扰。从实验室规模纯化蛋白质向工业化规模纯化生产蛋白质的扩大，属于工程学的范畴。工厂规模是一次性的，它必须成功。
Q2：规模化蛋白质纯化方案设计的主要步骤通常不超过几个？
规模化纯化蛋白质过程中，主要步骤通常不超过4～5个。要尽可能多地了解目的蛋白和杂质的物化性质，尽可能早使用高选择性的步骤，尽可能早分离除去数量最多的杂质，在分离纯化的早期一般是浓缩蛋白质并除去水，最后执行特别费时间或成本很高的步骤。
Q3：规模化细胞破碎有哪些方法？各有什么优缺点？
规模化细胞破碎主要有三种方法：1）均质法：产量可达6000 L/h，但不适用于高等真菌，产热高容易使蛋白变性、容易污染；2）研磨法：产量可达2000 L/h，适用于细菌与酵母细胞，但破碎效率不稳定、容易污染；3）酶解法：条件温和、损失较少，但条件摸索复杂、成本较高。
Q4：规模化纯化中色谱放大的原则是什么？
放大过程中的原则是保持色谱操作上样、吸附和洗脱的条件不变，包括样品的组成、离子交换剂的种类、样品介质比、起始和洗脱缓冲液的组成、pH和离子强度等，在此基础上根据样品量放大柱体积、洗脱剂的体积、流速等参数。柱体积的增大主要通过选用内径大的色谱柱来实现，柱高一般不宜有太大的增加。
Q5：FPLC在规模化蛋白纯化中有什么优势？
快速蛋白质液相色谱（FPLC）在中等压力条件下工作，比传统色谱分离速度更快、分离效果更好。FPLC在实验室中被广泛接受，在中试和大规模蛋白质纯化中也显示出了强大的潜力。相比于高压系统（如HPLC），其设备用塑料而非不锈钢制成，可耐任何缓冲液，因而适于分离纯化蛋白质。
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