GST融合蛋白纯化是实验室最常用的亲和纯化方法之一，核心是利用GST标签与谷胱甘肽（GSH）的特异性亲和实现一步纯化。原理清晰，但实际操作中每一步的参数控制都会影响最终纯化效果。
本文系统梳理GST融合蛋白纯化的完整操作流程——从缓冲液配方到10步纯化操作，再到GST柱的回收与再生，并附关键参数速查表与常见问题解答，可直接对照实验台使用。
本文内容速览：
- 一、GST纯化系统原理简述
- 二、实验试剂与缓冲液配方
- 三、具体纯化步骤（10步）
- 四、GST柱的回收与再生
- 五、关键参数速查表
- 六、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、GST纯化系统原理简述
GST纯化系统是利用GST（glutathione-S-transferase）融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过二硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。
该纯化柱中，凝胶手臂上通过硫键结合一个谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶（即GST-tag，26 kD）之间酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的手臂谷胱甘肽结合，从而将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。
洗脱原理：谷胱甘肽通常有氧化性GSSG和还原型GSH。当我们使用GSH洗脱时，GSH会与凝胶上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗脱下来。
凝胶手臂通过硫键结合谷胱甘肽，GST标签与谷胱甘肽特异性结合。洗脱时，游离的还原型GSH与凝胶上的谷胱甘肽竞争结合GST融合蛋白，将目标蛋白洗脱下来。
PART 02二、实验试剂与缓冲液配方
| GST纯化缓冲液 | 配方 |
|---|---|
| Lysis Buffer（裂解液） | 1× PBS；pH 7.4 |
| Elution Buffer 1（洗脱液） | 1× PBS；50 mM GSH；pH 7.4 |
裂解液选择要点：根据具体蛋白等电点 pI 值，选择合适的Buffer，在非变性裂解液中加入 1% Triton X-100、2 mM/ml PMSF，全程冰浴操作。
PART 03三、具体纯化步骤（10步）
每克菌加入 10–15 ml 的非变性裂解液 Lysis Buffer（1× PBS，pH 7.4）重悬。非变性裂解液的选择：根据具体蛋白等电点 pI 值选择合适的Buffer，在非变性裂解液中加入 1% Triton X-100、2 mM/ml PMSF。全程冰浴。
把混合非变性裂解液的菌体在冰水中用超声探头破碎，超声3 s，间隔6 s，超声5–10 min。超声完全的判断：溶液中有无块状物，溶液是否粘稠。
将破碎液用离心机离心 12000 r/min，4℃，30 min，取上清，此条件可重复两遍。然后把上清和沉淀分别留样，上清用于纯化。
取GST柱，清洗干净柱子，加入 2–3 ml GST柱（可根据具体GST的说明书选择合适的量），用非变性裂解液 Lysis Buffer 平衡柱子 5–10倍柱体积。
为了让柱子和上清充分结合，放置在旋转孵育器上孵育 2–4 h 后取出纯化，整个孵育过程在 4℃的层析柜中进行。
孵育结束后，将孵育好的蛋白过柱，流出取样。
用非变性裂解液 Lysis Buffer 洗去未吸附的样品，流速 1–3 ml/min，直到洗脱至流出液的紫外检测仪数值不再变化为止。
用 Elution Buffer 1 洗涤蛋白至紫外检测仪数值趋于稳定，流速 1–2 ml/min，收集样品，2 ml/管收集。
将收集的各浓度梯度洗脱下来的蛋白取样，跑 SDS-PAGE。
根据SDS-PAGE电泳图，分析进行下一步实验。
PART 04四、GST柱的回收与再生
取待再生的GST柱，将其倒入空层析柱中。
加入 ddH₂O 冲洗柱子，冲洗 5–10倍柱体积，流速 1–2 ml/min。
加入清洗液（50 mM Tris，150 mM NaCl，6 M 盐酸胍，pH 8.0）清洗柱子，冲洗 5–10倍柱体积，流速 1–2 ml/min。
加入 ddH₂O 冲洗柱子，冲洗 5–10倍柱体积，流速 1–2 ml/min。
取少量柱子制样跑胶，若无条带，可进行下一步操作。
将柱子储存在 20% 的乙醇中，放置在 4℃层析柜中待用。
速查五、关键参数速查表
| 阶段 | 关键操作 | 关键参数 |
|---|---|---|
| 收菌重悬 | 每克菌加裂解液重悬 | 10–15 ml/g；1% Triton X-100；2 mM/ml PMSF；全程冰浴 |
| 超声破碎 | 冰水中超声破碎 | 超声3 s，间隔6 s；超声5–10 min |
| 离心 | 离心取上清 | 12000 r/min，4℃，30 min；可重复两遍 |
| 柱子平衡 | Lysis Buffer 平衡GST柱 | 2–3 ml GST柱；5–10倍柱体积 |
| 孵育结合 | 旋转孵育器孵育 | 2–4 h；4℃层析柜 |
| 洗涤 | Lysis Buffer 洗去未吸附 | 流速 1–3 ml/min；至UV数值不变 |
| 洗脱 | Elution Buffer 1 洗脱 | 流速 1–2 ml/min；2 ml/管收集 |
| 检测 | SDS-PAGE | 分析各梯度洗脱组分 |
| GST柱回收 | ddH₂O + 6 M 盐酸胍清洗 | 各5–10倍柱体积；流速 1–2 ml/min |
| 柱子保存 | 20% 乙醇中储存 | 4℃层析柜 |
FAQ六、常见问题解答
Q1：GST纯化系统的原理是什么？
GST纯化系统是利用GST（glutathione-S-transferase）融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过二硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。凝胶手臂上通过硫键结合一个谷胱甘肽，利用谷胱甘肽与GST标签（26 kD）之间酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白与凝胶上的谷胱甘肽结合，从而将带标签的蛋白与其他蛋白分离。使用GSH洗脱时，GSH会与凝胶上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗脱。
Q2：超声破碎完全如何判断？
超声完全的判断标准有两个：一是溶液中没有块状物；二是溶液不再粘稠。超声条件一般为：超声3 s，间隔6 s，超声5–10 min，全程在冰浴中进行。
Q3：GST柱孵育为什么要在4℃进行？
为了让柱子和上清充分结合，放置在旋转孵育器上孵育2–4 h，整个孵育过程在4℃的层析柜中进行。低温可降低蛋白酶活性，减少蛋白降解，同时保持GST标签与谷胱甘肽的亲和活性。
Q4：GST柱如何回收与再生？
GST柱回收步骤如下：（1）取待再生的GST柱，倒入空层析柱中；（2）加入ddH₂O冲洗5–10倍柱体积；（3）加入6 M盐酸胍清洗液（50 mM Tris，150 mM NaCl，6 M盐酸胍，pH 8.0）冲洗5–10倍柱体积；（4）加入ddH₂O冲洗5–10倍柱体积；（5）取少量柱子制样跑胶，若无条带即可进入下一步；（6）将柱子储存在20%乙醇中，放置于4℃层析柜中待用。
Q5：非变性裂解液如何选择？
非变性裂解液的选择需要根据具体蛋白等电点pI值，选择合适的Buffer，并在非变性裂解液中加入1% Triton X-100、2 mM/ml PMSF。全程需冰浴操作。
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