毕赤酵母表达系统的产量和产物质量，很大程度上取决于宿主菌株的选择。目前已有大量不同基因型的毕赤酵母可用作表达宿主，不同菌株在甲醇利用能力、营养缺陷型、蛋白酶活性等方面存在显著差异。
本文系统梳理常用毕赤酵母宿主菌株类型、三种甲醇利用表型（Mut+ / Muts / Mut-）、表达宿主菌的选择原则，以及菌株遗传改造策略，并附速查表与常见问题解答。
本文内容速览：
- 一、常用毕赤酵母宿主菌株
- 二、三种甲醇利用表型（Mut+ / Muts / Mut-）
- 三、表达宿主菌的选择原则
- 四、菌株遗传改造策略
- 五、知识要点速查表
- 六、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、常用毕赤酵母宿主菌株
目前已有大量不同基因型的毕赤酵母可用作表达宿主，常用于外源基因表达的毕赤酵母菌株包括：
Mut+
Mut+
Mut+
his4 缺陷型
菌株选择的核心逻辑：不同菌株在甲醇利用能力、营养缺陷型、蛋白酶活性、转化方式适配性等方面存在差异，菌株的选择应根据具体需求而定。下文将从甲醇利用表型、表达类型（胞内/分泌）、筛选标记和蛋白酶缺陷四个维度展开。
PART 02二、三种甲醇利用表型
根据利用甲醇的能力，酵母菌株可分为3种表型：
| 表型 | 代表菌株 | 遗传特征 |
|---|---|---|
| 甲醇快利用型（Mut+） | X-33、SMD1168、GS115 等大部分菌株 | 同时含有编码醇氧化酶 AOX1 和 AOX2 基因 |
| 甲醇慢利用型（Muts） | KM71 | 只含 AOX2 基因，只能依赖 AOX2 产生 AOX |
| 甲醇不利用型（Mut−） | MC100-3 | AOX1 及 AOX2 基因均被敲除 |
有研究发现，在异源表达木质素过氧化物酶 H2 时，利用 X-33 菌株的表达量明显高于使用 SMD1168 菌株，这可能是由于 SMD1168 菌株中 pep4 基因对异源表达木质素过氧化物酶 H2 有负面影响。
PART 03三、表达宿主菌的选择原则
从研究结果来看，宿主菌的选择需要结合表达类型、筛选标记和蛋白酶活性三方面综合考虑：
3.1 根据表达类型选择
| 表达类型 | 推荐表型 |
|---|---|
| 蛋白胞内表达 | 可优先考虑用 Muts 表型 |
| 分泌表达 | Mut+ 和 Muts 都可使用 |
3.2 利用营养缺陷型筛选重组子
SMD1168、GS115、KM-71等大部分酵母菌株也是组氨酸脱氢酶缺陷型（his4），可据此利用不含组氨酸的培养基筛选重组子。
3.3 利用蛋白酶缺陷型减少降解
SMD1163、SMD1165和SMD1168等为蛋白酶缺陷型，因此可有效降低外源目的蛋白的酶解。这一特性对于表达易被蛋白酶降解的目的蛋白尤为重要。
选择原则小结：胞内表达 → 优先 Muts；分泌表达 → Mut+ 或 Muts；需要 his4 筛选 → GS115、KM71、SMD1168；目的蛋白易降解 → SMD1163 / SMD1165 / SMD1168（蛋白酶缺陷型）。
PART 04四、菌株遗传改造策略
4.1 蛋白酶基因失活
在菌株遗传改造方面，人工失活毕赤酵母的某些蛋白酶基因，获得稳定的突变体也可有效减少外源蛋白的降解。例如：
- 毕赤酵母 YPS1 基因的失活可明显减少人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白的降解。
4.2 非标记遗传修饰
最近报道，非标记遗传修饰对菌株改造具有重要意义。这种方法的核心设计是：
- 在载体 AOX1 后引入 mazF 基因，形成 mazF-ZeoR 表达框。
- 两侧包含 CYC1 TT 同向重复重组位点和多克隆位点。
- 以 Zeocin 抗性为正筛选标记，以 mazF 基因为反筛选标记。
菌株遗传修饰时，首先通过 Zeocin 筛选出基因改造的菌株，再进行甲醇诱导表达 mazF，实现遗传标记的再利用。这样既可以完成菌株的遗传改造，又不会引入非必要遗传标记。
应用实例：使用此方法，研究者成功进行了毕赤酵母 ARG1 和 MET2 基因敲除、绿色荧光蛋白基因的敲入及 ARG1 基因的定点突变，最终均未引起非必要遗传标记的保留。
速查五、知识要点速查表
| 知识点 | 关键内容 |
|---|---|
| 常用菌株 | SMD1168(H)、SMD1165、SMD1163、GS115、X-33、MP-36、MC100-3、KM71(H) |
| Mut+（快利用型） | X-33、SMD1168、GS115 等；含 AOX1 + AOX2 |
| Muts（慢利用型） | KM71；只含 AOX2 |
| Mut−（不利用型） | MC100-3；AOX1 及 AOX2 均被敲除 |
| 胞内表达推荐 | 优先选择 Muts 表型 |
| 分泌表达推荐 | Mut+ 和 Muts 均可使用 |
| his4 缺陷型菌株 | SMD1168、GS115、KM-71；可用不含组氨酸培养基筛选 |
| 蛋白酶缺陷型菌株 | SMD1163、SMD1165、SMD1168；有效降低外源蛋白酶解 |
| 蛋白酶基因失活案例 | YPS1 基因失活 → 减少 HSA-CNTF 融合蛋白降解 |
| 非标记遗传修饰 | AOX1 后引入 mazF-ZeoR 表达框；Zeocin 正筛 + mazF 反筛 |
FAQ六、常见问题解答
Q1：目前常用的毕赤酵母宿主菌株有哪些？
目前已有大量不同基因型的毕赤酵母可用作表达宿主，常用于外源基因表达的毕赤酵母菌株有 SMD1168(H)、SMD1165、SMD1163、GS115、X-33、MP-36、MC100-3、KM71(H) 等，菌株的选择应根据具体需求而定。
Q2：毕赤酵母根据甲醇利用能力可分为哪几种表型？
根据利用甲醇的能力，酵母菌株可分为3种表型：1）甲醇快利用型（Mut+），包括X-33、SMD1168与GS115等大部分菌株，此类菌株同时含有编码醇氧化酶AOX1和AOX2；2）甲醇慢利用型（Muts），如KM71菌株，其中只含AOX2基因，只能依赖AOX2产生AOX；3）甲醇不利用型（Mut−），如MC100-3，其AOX1及AOX2基因均被敲除。
Q3：胞内表达和分泌表达分别应该选择什么表型的菌株？
从研究结果来看，蛋白胞内表达时，可优先考虑用 Muts 表型；对于分泌表达，Mut+ 和 Muts 都可使用。
Q4：如何利用 his4 缺陷型筛选重组子？
SMD1168、GS115、KM-71等大部分酵母菌株也是组氨酸脱氢酶缺陷型（his4），可据此利用不含组氨酸的培养基筛选重组子。
Q5：如何通过遗传改造减少外源蛋白的降解？
SMD1163、SMD1165和SMD1168等为蛋白酶缺陷型，因此可有效降低外源目的蛋白的酶解。在菌株遗传改造方面，人工失活毕赤酵母的某些蛋白酶基因，获得稳定的突变体也可有效减少外源蛋白的降解，如毕赤酵母YPS1基因的失活可明显减少人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白的降解。
Q6：什么是非标记遗传修饰？有什么意义？
非标记遗传修饰是在载体AOX1后引入mazF基因，形成mazF-ZeoR表达框，同时两侧包含CYC1 TT同向重复重组位点和多克隆位点，这样可以Zeocin抗性为正筛选标记，以mazF基因为反筛选标记。菌株遗传修饰时，首先通过Zeocin筛选出基因改造的菌株，再进行甲醇诱导表达mazF，实现遗传标记的再利用，这样既可以完成菌株的遗传改造，又不会引入非必要遗传标记。使用此方法，研究者成功进行了毕赤酵母ARG1和MET2基因敲除和绿色荧光蛋白基因的敲入及ARG1基因的定点突变，最终均未引起非必要遗传标记的保留。
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