项目	信息
文献标题	Bacteroides fragilis toxin promotes gall bladder cancer in mice
文献译名	脆弱拟杆菌毒素促进小鼠胆囊癌进展
期刊名称	Nature Microbiology
发表时间	2026年6月25日
影响因子	19.4
通讯作者	刘颖斌、齐晶晶、吴文广
单位	上海交通大学医学院附属仁济医院

研究背景

胆囊癌（Gallbladder cancer, GBC）是胆道系统最致命的恶性肿瘤，因进展迅猛、治疗匮乏，预后极差。其发生受遗传与环境因素共同影响，近年来胆道微生物群被发现在胆石症、胆囊息肉乃至胆囊癌中扮演重要角色。约15–20%的癌症与病原微生物相关，但胆囊内微生物组及其致癌机制尚不明确。脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）本是人体胃肠道的常见共生菌，是人类健康肠道微生态的“常客”——然而，一个特殊的产肠毒素亚型（ETBF）却被发现与肿瘤风险升高有关。这位看似无害的“常客”为何会变成胆囊的“刺客”？它如何突破微生态平衡，主动驱动恶性肿瘤的发生？

本研究中，仁济医院团队首次系统阐明：ETBF通过其表面蛋白MltD结合胆囊癌细胞受体TMPRSS13，激活JAK2-STAT3信号直接促进肿瘤增殖；同时，其分泌的毒素BFT通过NF-κB上调CXCL1，招募髓源性抑制细胞（MDSCs）并促进血管生成，间接重塑促肿瘤微环境。这一双重机制为胆囊癌的微生物病因学提供了全新视角，也为靶向ETBF或其相关通路的防治策略奠定了理论基础。钟鼎生物协助完成了蛋白表达、GST pull-down 等实验，为MltD-TMPRSS13相互作用的验证提供了重要技术支持。

研究思路

1.临床样本分析——ETBF在胆囊癌中富集

通过宏基因组测序、RT-qPCR和FISH等技术，比较胆囊癌肿瘤组织与癌旁组织中ETBF的丰度差异。

2.功能表型分析——细胞/类器官/动物水平

ETBF与胆囊癌细胞共培养、患者来源类器官实验、小鼠皮下移植瘤模型，评估ETBF对胆囊癌增殖、迁移、侵袭的影响。

3.关键毒力因子鉴定——BFT依赖性验证

构建bft基因敲除ETBF菌株（ETBF Δbft），验证BFT是否为ETBF促肿瘤效应的关键因子。

4.细菌-宿主互作机制——MltD-TMPRSS13轴发现

① 生物素pull-down联合质谱鉴定ETBF表面蛋白MltD
② GST pull-down联合质谱鉴定宿主受体TMPRSS13
③ 构建mltD基因敲除菌株和TMPRSS13敲除细胞系验证功能

5.下游信号通路解析——JAK2-STAT3通路

RNA-seq转录组分析结合Western blot验证ETBF通过BFT-MltD-TMPRSS13轴激活JAK2-STAT3信号通路。

6. 肿瘤微环境重塑机制——BFT-NF-κB-CXCL1-MDSCs-血管生成轴

① 细胞因子芯片筛选ETBF诱导的CXCL1分泌
② 验证BFT通过NF-κB p65上调CXCL1
③ 流式细胞术检测MDSCs浸润
④ CD31免疫组化评估血管生成
⑤ 抗Gr-1抗体清除MDSCs、贝伐珠单抗抑制血管生成验证功能

主要研究发现

1.ETBF在胆囊癌组织中显著富集

研究者首先对25例胆囊癌患者的肿瘤组织（T）和癌旁组织（PT）进行了宏基因组鸟枪法测序。结果显示，脆弱拟杆菌在肿瘤组织中的相对丰度显著高于癌旁组织（图1a-b）。RT-qPCR进一步验证了这一发现（n=29）。

通过FISH（荧光原位杂交）使用Cy3标记的ETBF特异性探针，研究者直接在胆囊癌组织切片中观察到ETBF的存在（图1d）。免疫荧光共定位分析进一步显示，ETBF主要定位于CK19⁺上皮细胞周围，而非CD45⁺免疫细胞区域，提示ETBF直接与肿瘤上皮细胞相互作用（图1e）。

此外，对慢性结石性胆囊炎（CCC）、癌前病变和胆囊癌组织的PCR检测显示，ETBF阳性率从CCC到癌前病变到胆囊癌呈逐步上升趋势，提示ETBF可能在胆囊癌变过程中发挥重要作用。

图1 脆弱拟杆菌在胆囊癌肿瘤组织中大量聚集

2、ETBF以BFT依赖方式促进胆囊癌进展

体外实验中，ETBF与胆囊癌细胞系（NOZ和GBC-SD）共培养后，显著促进了细胞增殖（CCK-8实验）、集落形成能力、迁移和侵袭能力（Transwell实验），并诱导了上皮-间质转化（EMT）。患者来源的胆囊癌类器官实验中，ETBF同样显著加速了类器官的生长。

体内实验中，在BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型中，瘤内注射ETBF显著促进了肿瘤生长，肿瘤体积和重量均显著增加，Ki-67增殖指数也明显升高（图2d-g）。

关键发现：当敲除ETBF的bft基因（ETBF Δbft）后，上述所有促肿瘤效应均被消除——细胞增殖不再增强、类器官不再加速生长、小鼠肿瘤不再增大。这明确证明BFT是ETBF驱动胆囊癌进展的核心毒力因子。然而，令人意外的是，单独使用ETBF条件培养基或重组BFT（rBFT）均不能直接促进胆囊癌细胞增殖。这一矛盾提示BFT的促肿瘤作用依赖于完整的细菌和/或肿瘤微环境。

图 2 产肠毒素型脆弱拟杆菌依靠脆弱拟杆菌毒素推动胆囊癌进展

3、ETBF通过表面蛋白MltD优先黏附胆囊癌细胞

ETBF对胆囊癌细胞系（NOZ、GBC-SD）的黏附能力显著高于正常胆囊黏膜上皮细胞系L-2F7（图3a）。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）证实ETBF紧密黏附于胆囊癌细胞表面，但未侵入细胞内部。

为鉴定介导这种优先黏附的细菌表面蛋白，研究者进行了生物素pull-down实验：将生物素标记的胆囊癌细胞膜蛋白与ETBF膜蛋白共孵育，再用链霉亲和素磁珠pull-down，结合质谱分析，鉴定出6个候选蛋白。其中，MltD（膜结合溶菌性胞壁质转糖基酶D） 是唯一已知定位于细菌外膜的蛋白。

构建mltD基因敲除菌株（ETBF ΔmltD）后，ETBF对胆囊癌细胞的黏附能力显著下降，体内促肿瘤能力也完全丧失（图3e-i）。这表明MltD是ETBF黏附胆囊癌细胞的关键表面黏附素。

图3 ETBF通过表面蛋白MltD优先黏附于胆囊癌细胞

4、MltD直接结合宿主受体TMPRSS13

为鉴定胆囊癌细胞上MltD的对应受体，研究者表达了GST标签的MltD重组蛋白，进行GST pull-down实验，联合质谱分析从NOZ和GBC-SD细胞膜蛋白中鉴定出7个候选互作蛋白。其中，TMPRSS13（跨膜丝氨酸蛋白酶13） 是唯一的整合膜蛋白。

Co-IP实验进一步证实了MltD与TMPRSS13的直接相互作用（图4c）。RT-qPCR和Western blot显示，TMPRSS13在胆囊癌细胞系中的表达水平显著高于正常胆囊黏膜上皮细胞，这与ETBF对胆囊癌细胞的优先黏附特性完全吻合。

利用CRISPR-Cas9敲除TMPRSS13后，ETBF的黏附能力下降，促肿瘤能力丧失；而重新表达TMPRSS13则恢复了这些效应（图4e-i）。这证明MltD-TMPRSS13相互作用是ETBF黏附和促肿瘤功能的关键分子基础。

图4 MltD–TMPRSS13轴介导ETBF与GBC细胞的粘附，并促进肿瘤生长。

5、BFT通过上调TMPRSS13增强MltD-TMPRSS13依赖的黏附

一个关键问题是：mltD在ETBF和NTBF中均有表达，为何只有ETBF具有促肿瘤效应？

研究者发现，ETBF的黏附能力显著强于NTBF，而敲除bft后黏附能力下降。补充rBFT可增强NTBF的黏附和促肿瘤能力，但这种增强作用在mltD敲除的NTBF中消失。

机制上，BFT通过激活NF-κB p65信号通路上调TMPRSS13的表达：
① BFT处理增加TMPRSS13蛋白水平；
② BFT激活NF-κB p65磷酸化；
③ 双荧光素酶报告基因实验证实p65直接结合TMPRSS13启动子；
④ NF-κB抑制剂JSH-23可逆转BFT诱导的TMPRSS13上调。
因此，BFT虽然不能直接促进细胞增殖，但通过上调TMPRSS13表达，增强了ETBF的MltD-TMPRSS13依赖的黏附定殖能力。

6、ETBF通过BFT-MltD-TMPRSS13轴激活JAK2-STAT3信号

RNA-seq分析显示，ETBF处理NOZ细胞后，JAK-STAT、NF-κB和mTOR等致癌信号通路显著激活。Western blot证实ETBF处理显著增加了p-JAK2和p-STAT3水平。

敲除bft或mltD后，ETBF诱导的JAK2-STAT3磷酸化被消除。补充rBFT可使NTBF获得激活JAK2-STAT3的能力，但mltD敲除的NTBF即使补充rBFT也无法激活。敲除TMPRSS13同样消除了ETBF诱导的JAK2-STAT3磷酸化。

这些结果清晰地勾勒出一条完整的信号通路：ETBF → BFT（上调TMPRSS13） → MltD-TMPRSS13结合 → JAK2-STAT3激活 → 肿瘤细胞增殖

图5 ETBF通过BFT–MltD–TMPRSS13轴激活JAK2–STAT3信号通路。

7、ETBF通过BFT-NF-κB-CXCL1轴招募MDSCs促进血管生成

细胞因子芯片分析发现，ETBF处理NOZ细胞后，CXCL1是最显著上调的趋化因子。ELISA和RT-qPCR验证了这一结果。

机制上，BFT通过激活NF-κB p65信号通路上调CXCL1的分泌和表达：NF-κB抑制剂JSH-23可逆转BFT诱导的CXCL1上调。

在体内，ETBF处理的小鼠肿瘤中MDSCs（CD45⁺CD11b⁺Gr-1⁺）浸润显著增加，同时血管生成（CD31染色）明显增强（图6f-g）。而ETBF Δbft处理组无此效应。

单独注射rBFT同样能促进肿瘤生长、招募MDSCs和增强血管生成（图6i-m）。HUVEC管形成实验证实MDSCs条件培养基可促进血管生成，而贝伐珠单抗（抗VEGF抗体） 可抑制这一效应。

使用抗Gr-1抗体清除MDSCs或贝伐珠单抗抑制血管生成，均可显著逆转BFT的促肿瘤效应。

图6 ETBF通过BFT诱导的NF-κB激活、促炎细胞因子分泌、髓样抑制性细胞（MDSC）募集和血管生成来促进GBC（胆囊癌）进展。

8、ETBF改变胆汁酸代谢谱

代谢组学分析显示，ETBF定殖显著改变了小鼠胆囊微环境中的胆汁酸谱：牛磺鹅去氧胆酸和甘氨鹅去氧胆酸-3-O-β-葡萄糖醛酸苷增加，牛磺-β-鼠胆酸和熊去氧胆酸减少。KEGG通路富集分析显示初级胆汁酸生物合成通路显著激活。

整体机制模型

基于上述发现，研究者提出了ETBF促进胆囊癌进展的双重机制模型：

第一重：细菌-宿主直接互作（肿瘤细胞内在效应）
ETBF分泌BFT → BFT激活NF-κB上调TMPRSS13 → ETBF表面蛋白MltD结合TMPRSS13 → 激活JAK2-STAT3信号 → 促进胆囊癌细胞增殖

第二重：肿瘤微环境重塑（非细胞自主效应）
ETBF分泌BFT → BFT激活NF-κB → 诱导CXCL1分泌 → 招募MDSCs → 促进VEGF依赖性血管生成 → 营造促肿瘤微环境

这两条通路协同作用，共同驱动胆囊癌的进展。

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