杆状病毒表达载体系统（BEVS）是目前应用最广泛的高效真核表达系统之一。用于外源基因表达的杆状病毒载体主要是苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒（AcMNPV）和家蚕核多角体病毒（BmNPV），利用其多角体蛋白强启动子构建的重组杆状病毒表达外源基因具有高效高产的优势。
本文系统梳理杆状病毒的基本介绍、野生型杆状病毒生命周期的三个阶段、Bac-to-Bac体系的组成以及位点特异性转座制备重组杆状病毒的原理，并附知识要点速查表与常见问题解答。
本文内容速览：
- 一、杆状病毒介绍
- 二、野生型杆状病毒的生命周期（三阶段）
- 三、重组杆状病毒的构建策略
- 四、Bac-to-Bac体系组成
- 五、位点特异性转座制备重组杆状病毒的原理
- 六、知识要点速查表
- 七、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、杆状病毒介绍
杆状病毒是已知的感染昆虫种群最为常见的病毒，其结构为棒状衣壳蛋白包裹双链、环状、超螺旋的DNA分子。
已经鉴定了超过 500 种分离到的杆状病毒（基于宿主分类），其中大多数杆状病毒分离自节肢动物，特别是鳞翅目昆虫。病毒形态主要有：
| 类型 | 代表病毒 |
|---|---|
| 核型多角体病毒（NPV） | 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV） |
| 颗粒体病毒（GV） | 苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV） |
用于外源基因表达的载体：目前还没有找到支持GV病毒长期复制传代的细胞系。用于外源基因表达的杆状病毒载体是苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒（AcMNPV）和家蚕核多角体病毒（BmNPV）。重组杆状病毒已广泛用于在培养的昆虫细胞和昆虫幼虫中表达异源基因，对于大规模生产，杆状病毒表达载体系统（BEVS）具备高效高产的优势。
PART 02二、野生型杆状病毒的生命周期
野生型杆状病毒的生命周期主要分为以下三个阶段：
-
1
病毒DNA合成期
这一阶段病毒使受感染的细胞准备复制病毒DNA。这一过程包括病毒附着细胞、核酸渗透入细胞、衣壳脱落、早期病毒基因表达和关闭宿主基因表达。
初始病毒合成：感染后 0.5～6 小时 -
2
病毒结构期
该阶段表达编码病毒DNA复制和病毒组装的晚期基因。在感染后6至12小时，细胞开始产生细胞外病毒（EV），也称为非闭塞病毒（NOV）或芽生病毒（BV）。EV包含通过胞吞作用进入病毒所必需的质膜包膜和糖蛋白。
EV释放峰值：感染后 18～36 小时 -
3
病毒闭塞蛋白阶段
表达多角体蛋白和p10基因，形成封闭病毒（OV）——也称为封闭体（OB）或多面体包涵体（PIB），此时细胞裂解开始。产生的多个病毒粒子并被结晶多面体基质包围。OV含有核膜包膜和病毒多肽gp41和gp74。
OV产生：感染后 24～96 小时
PART 03三、重组杆状病毒的构建策略
将野生型杆状病毒的多角体蛋白基因同源重组替换为目的基因或cDNA构建重组体，可用于体外感染昆虫细胞表达外源基因。外源基因在多角体蛋白和p10启动子的控制下进行表达，因此，表达重组产物代替天然存在的多角体蛋白，重组蛋白质被加工、修饰并靶向适当的细胞位置。
| 策略 | 特点 | 局限 / 优势 |
|---|---|---|
| 同源重组 | 早期经典方法 | 重组成功率较低，耗时长，操作复杂，成本高 |
| 位点特异性转座 | 现在实验和生产中的主流方法 | 商业化成熟体系为 Invitrogen 的 Bac-to-Bac 体系 |
方法演进：使用同源重组的方式产生重组杆状病毒，重组成功率较低，耗时长操作复杂，成本高。现在实验和生产中通常使用位点特异性转座来获得重组杆状病毒，商业化成熟的表达体系是 Invitrogen 的 Bac-to-Bac 体系。
PART 04四、Bac-to-Bac体系组成
Bac-to-Bac体系由两个核心组分构成：
Tn7 转座子内含有多角体蛋白强启动子和多克隆位点。目的基因即克隆到此载体的多克隆位点中，由多角体蛋白强启动子驱动表达。
含有亲本 Bacmid 的 bMON14272 和辅助质粒 pMON7124。亲本Bacmid提供mini-attTn7靶位点，辅助质粒提供转座蛋白，二者共同完成位点特异性转座。
PART 05五、位点特异性转座制备重组杆状病毒的原理
通过 Tn7 的位点特异性转座将外源基因插入在大肠杆菌中繁殖的杆粒DNA中。整个流程的核心步骤是：
将目的基因克隆到 pFastBac 载体中，使目的基因位于 Tn7 转座子内的多角体蛋白强启动子下游。
将重组质粒转化到 DH10Bac 感受态细胞中，该细胞含有具有 mini-attTn7 靶位点和辅助质粒的杆粒。
在辅助质粒提供的转座蛋白存在下，pFastBac 质粒上的 mini-Tn7 元件可以转座到杆粒上的 mini-attTn7 靶位点。
含有重组杆粒的菌落通过抗生素选择和蓝/白筛选鉴定，因为转座导致 lacZα 基因的破坏（白色菌落为阳性重组子）。
从含有重组杆粒的大肠杆菌中制备杆粒，然后将该杆粒用于转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒。
图1 Bac-to-Bac 位点特异性转座制备重组杆状病毒原理
核心优势：相比传统的同源重组方法，Bac-to-Bac 体系通过在大肠杆菌中完成转座和筛选，省去了繁琐的空斑纯化步骤，将重组杆状病毒的制备周期从数周缩短至数天，且重组效率接近100%。
速查六、知识要点速查表
| 知识点 | 关键内容 |
|---|---|
| 杆状病毒结构 | 棒状衣壳蛋白包裹双链、环状、超螺旋DNA分子 |
| 已知分离种类 | 超过500种（基于宿主分类），主要来自鳞翅目昆虫 |
| 两种主要形态 | 核型多角体病毒（NPV）和颗粒体病毒（GV） |
| 表达载体来源 | AcMNPV（苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒）和 BmNPV（家蚕核多角体病毒） |
| 生命周期三阶段 | 病毒DNA合成期 → 病毒结构期 → 病毒闭塞蛋白阶段 |
| EV释放峰值 | 感染后 18～36 小时 |
| OV产生时间 | 感染后 24～96 小时 |
| 构建策略 | 同源重组（旧）→ 位点特异性转座（新，Bac-to-Bac体系） |
| Bac-to-Bac组分一 | pFastBac载体：Tn7转座子含多角体蛋白强启动子 + 多克隆位点 |
| Bac-to-Bac组分二 | DH10Bac感受态细胞：亲本Bacmid bMON14272 + 辅助质粒pMON7124 |
| 转座元件 | mini-Tn7（pFastBac）→ mini-attTn7（杆粒） |
| 筛选方式 | 抗生素选择 + 蓝/白筛选（lacZα基因破坏） |
FAQ七、常见问题解答
Q1：杆状病毒的结构和分类是怎样的？
杆状病毒是已知的感染昆虫种群最为常见的病毒，其结构为棒状衣壳蛋白包裹双链、环状、超螺旋的DNA分子。已经鉴定了超过500种分离到的杆状病毒（基于宿主分类），其中大多数杆状病毒分离自节肢动物，特别是鳞翅目昆虫。病毒形态主要有核型多角体病毒（NPV）和颗粒体病毒（GV），代表有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）和苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）。
Q2：用于外源基因表达的杆状病毒载体主要是哪两种？
目前还没有找到支持GV病毒长期复制传代的细胞系。用于外源基因表达的杆状病毒载体是苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒（AcMNPV）和家蚕核多角体病毒（BmNPV）。重组杆状病毒已广泛用于在培养的昆虫细胞和昆虫幼虫中表达异源基因，对于大规模生产，杆状病毒表达载体系统（BEVS）具备高效高产的优势。
Q3：野生型杆状病毒的生命周期分为哪几个阶段？
野生型杆状病毒的生命周期主要分为三个阶段：1）病毒DNA合成期——病毒使受感染的细胞准备复制病毒DNA，包括病毒附着细胞、核酸渗透入细胞、衣壳脱落、早期病毒基因表达和关闭宿主基因表达，实际的初始病毒合成在感染后0.5至6小时发生；2）病毒结构期——表达编码病毒DNA复制和病毒组装的晚期基因，感染后6至12小时细胞开始产生细胞外病毒（EV），释放峰值在感染后18至36小时；3）病毒闭塞蛋白阶段——表达多角体蛋白和p10基因，形成封闭病毒（OV），感染后24至96小时细胞开始产生OV，产生的多个病毒粒子并被结晶多面体基质包围。
Q4：Bac-to-Bac体系的组成是什么？
Bac-to-Bac体系主要包括两个核心组分：1）pFastBac载体——Tn7转座子内含有多角体蛋白强启动子和多克隆位点；2）DH10Bac感受态细胞——含有亲本Bacmid的bMON14272和辅助质粒pMON7124。
Q5：位点特异性转座制备重组杆状病毒的原理是什么？
通过Tn7的位点特异性转座将外源基因插入在大肠杆菌中繁殖的杆粒DNA中。将目的基因克隆到pFastBac载体中，将重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中，该细胞含有具有mini-attTn7靶位点和辅助质粒的杆粒。在辅助质粒提供的转座蛋白存在下，pFastBac质粒上的mini-Tn7元件可以转座到杆粒上的mini-attTn7靶位点。含有重组杆粒的菌落通过抗生素选择和蓝/白筛选鉴定，因为转座导致lacZα基因的破坏。从含有重组杆粒的大肠杆菌中制备杆粒，然后将该杆粒用于转染昆虫细胞。
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