当前动物细胞大规模发酵工艺中的主流方向是搅拌式悬浮连续发酵工艺，特别是抗体等大规模蛋白表达。在工业化生产中，悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制比其他发酵系统更易理解和掌握，因此在大规模动物细胞发酵生产中多选择此种工艺。
通常，一个好的细胞发酵平台可适用于多种不同重组蛋白或抗体的大规模表达，选择适宜的平台技术可有效减少工艺研究过程的时间。本文系统梳理动物细胞大规模发酵的多种工艺路线，附工艺对比速查表与常见问题解答。
本文内容速览：
- 一、动物细胞发酵工艺总览
- 二、动物细胞悬浮发酵工艺（主流方向）
- 三、流加发酵工艺与灌流发酵工艺
- 四、动物细胞贴壁发酵工艺
- 五、WAVE bioreactor 细胞发酵工艺
- 六、动物细胞规模化瞬时表达系统
- 七、工艺对比速查表
- 八、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、动物细胞发酵工艺总览
悬浮贴壁细胞培养的传统方法是采用转瓶、堆积床和悬浮微载体培养，转瓶和堆积床培养的放大生产受到很多的限制，而悬浮微载体培养是目前疫苗生产经常采用的一种形式。
非传统的贴壁细胞培养选用气升式细胞发酵系统、膜透析生物反应器和填充床灌流培养等。
动物细胞大规模发酵系统示意
选择逻辑：选择哪种发酵工艺，取决于细胞类型（贴壁/悬浮）、产物需求（克级/大规模）、时间窗口（研发/生产/应急）和成本考量。以下各节将分别展开五种主流工艺。
PART 02二、动物细胞悬浮发酵工艺
悬浮发酵工艺（suspension culture）是指细胞自由悬浮于培养液内生长增殖的一种发酵方法。目前该项技术发展较快，已逐渐趋向成熟。
| 优点 | 缺点 |
|---|---|
| 操作便捷、产率高、易放大 | 技术较为复杂、产物回收量大、培养液利用率有待提升 |
悬浮发酵工艺适于许多工程细胞，例如 CHO、HEK293、杂交瘤、SP2/0、NS0 等。
PART 03三、流加发酵工艺与灌流发酵工艺
3.1 流加发酵工艺（fed-batch culture）
采用细胞搅拌式发酵系统连续悬浮培养的方式。细胞初始接种的培养液体积一般为终体积的 1/2～1/3，在发酵过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养液，从而使细胞持续生长至较高的密度，重组蛋白表达达到较高的水平，在细胞进入衰亡期后终止发酵，分离、纯化目标产品。
流加发酵两大关键因素：① 流加培养液的稀释率；② 生长限制性底物浓度。在此工艺中，通过氧气的限制可避免底物中限制性代谢产物浓度的增加，因而可获得更高的细胞密度和产量。
3.2 灌流发酵工艺（perfusion culture）
一种常用的发酵工艺，多采用搅拌式细胞发酵系统，也可采用管式系统。在发酵过程中，不断向发酵罐灌流培养液，同时以相同流量流出。
- 可在发酵过程中不断去除细胞碎片和副产物，降低细胞死亡后释放的各种酶类可能对产物的影响。
- 由于连续不断地灌流新鲜培养液，可提供一个较恒定的培养环境，因此可获得较高的单位体积产率。
- 由于灌流系统多采用细胞截留与回收系统，因而可实现细胞的高密度发酵。
PART 04四、动物细胞贴壁发酵工艺
贴壁发酵工艺（anchorage-dependent culture）是一种让细胞贴附在某种基质（或载体）上进行增殖的工艺，主要适用于贴壁细胞，也适用于兼性贴壁细胞。实际生产中具有贴壁生长特性的细胞种类较多，如 CHO、BHK、Vero 细胞等。
- 细胞可贴附于发酵介质内外表面，有效地表达重组蛋白。
- 容易进行培养液的更换，培养过程中不断添加新鲜培养液，去除代谢产物。
- 使单位体积内细胞密度较高，与悬浮培养相比可维持的培养周期相对较长。
由于贴壁细胞的生长要求，提高细胞密度的有效方法就是使反应体系中比表面积最大化。传统的贴壁细胞培养方法包括转瓶（roller bottle）、多层平板培养。转瓶和多层平板培养大多应用于产品研发的早、中期，如红细胞生成素、基因治疗产品和疫苗生产等。
- 不能有效监测细胞生长。
- 操作比较繁琐，需要合适的贴附材料以及足够的贴附面积。
- 传质和传氧差，培养条件不均一。
- 这些因素使其放大培养受到限制，因而在实际生产中培养规模较小。
PART 05五、WAVE bioreactor 细胞发酵工艺
WAVE bioreactor细胞发酵工艺是采用具有创新概念的一次性使用的WAVE波浪袋作为细胞发酵容器，用于替代传统的不锈钢发酵罐。
- 降低污染风险：采用一次性使用的技术和材料，消除了日常清洗、消毒以及验证的需要，大大降低了传统罐的常见污染和交叉污染。
- 降低成本：大幅度减少了企业在细胞培养、培养基制备、缓冲液溶解、生物制品解冻等环节的固定资产和操作成本投资。
- 快速投产：系统安装方便，可快速投入工作，极大地缩短了生物技术产品投放至市场的时间。
- 适用场景：特别适用于临床用量较小的治疗性产品与诊断制剂的规模化制备。
| 参数 | 指标 |
|---|---|
| 全球投入使用量 | 数百台系统已经投入使用 |
| 最大规模 | 可达 500 L |
| 最高细胞密度 | 达 6 × 10⁷ cells/ml |
| 适用细胞类型 | CHO、NS0、HEK293、杂交瘤、T细胞和初级人类细胞等 |
PART 06六、动物细胞规模化瞬时表达系统
随着人类基因组计划的完成，当前的热点是如何快速、高效地解析基因的功能；而对于生物技术企业而言，当务之急是如何找到并同时尽快获得具有治疗价值的创新药靶来进行有效性和安全性评价。
瞬时表达系统为具有治疗价值的创新药靶筛选与评价提供了一种大规模蛋白表达的方式，包括：
- 前期 DNA 制备
- 细胞扩增
- 聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）介导的基因转染
时间优势：在不到 1 个月时间即可获得大规模重组蛋白，用于实验室研究和临床前产品研究，以及应急状态下的产品需求等。这对于争分夺秒的新药筛选和应急响应场景尤为关键。
速查七、工艺对比速查表
| 工艺 | 核心特点 | 适用细胞 / 场景 | 优势与局限 |
|---|---|---|---|
| 悬浮发酵 | 细胞自由悬浮于培养液内生长增殖 | CHO、HEK293、杂交瘤、SP2/0、NS0 | 操作便捷、产率高、易放大；技术较复杂 |
| 流加发酵（fed-batch） | 初始体积为终体积1/2～1/3，流加浓缩营养物 | 搅拌式发酵系统；抗体等大规模表达 | 高细胞密度、高产量；依赖稀释率与底物浓度控制 |
| 灌流发酵（perfusion） | 连续灌流新鲜培养液，同时等流量流出 | 搅拌式或管式系统；细胞截留与回收 | 去除细胞碎片和副产物、环境恒定、单位体积产率高；系统复杂 |
| 贴壁发酵 | 细胞贴附于基质或载体上增殖 | CHO、BHK、Vero等贴壁细胞 | 表达重组蛋白有效、周期长；传质传氧差、放大受限 |
| WAVE bioreactor | 一次性波浪袋替代不锈钢罐 | CHO、NS0、HEK293、杂交瘤、T细胞等 | 降低污染、降低成本、快速投产；最大500L，6×10⁷ cells/ml |
| 瞬时表达系统 | DNA制备 + 细胞扩增 + PEI介导转染 | 创新药靶筛选与评价、应急产品需求 | 不到1个月即可获得大规模重组蛋白；适合早期研究和临床前 |
FAQ八、常见问题解答
Q1：当前动物细胞大规模发酵工艺的主流方向是什么？
当前动物细胞大规模发酵工艺中的主流方向是搅拌式悬浮连续发酵工艺，特别是抗体等重组蛋白的大规模表达。在工业化生产中，悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制比其他发酵系统更易理解和掌握，因此在大规模动物细胞发酵生产中多选择此种工艺。
Q2：流加发酵工艺（fed-batch）的关键因素是什么？
流加发酵工艺的关键主要取决于两大因素，即流加培养液的稀释率和生长限制性底物浓度。在此工艺中，通过氧气的限制可避免底物中限制性代谢产物浓度的增加，因而可获得更高的细胞密度和产量。细胞初始接种的培养液体积一般为终体积的1/2～1/3，在发酵过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养液。
Q3：灌流发酵工艺（perfusion）有什么优势？
灌流工艺的优点是可在发酵过程中不断去除细胞碎片和副产物，降低细胞死亡后释放的各种酶类可能对产物的影响。同时，由于连续不断地灌流新鲜培养液而提供一个较恒定的培养环境，因此可获得较高的单位体积产率。由于灌流系统多采用细胞截留与回收系统，因而可实现细胞的高密度发酵。
Q4：贴壁发酵工艺的局限是什么？
贴壁培养的不足之处就是不能有效监测细胞生长，操作比较繁琐，需要合适的贴附材料以及足够的贴附面积，传质和传氧差，培养条件不均一等等，这些因素使其放大培养受到限制，因而在实际生产中培养规模较小。
Q5：WAVE bioreactor 有什么特点和优势？
WAVE bioreactor采用一次性使用的WAVE波浪袋作为细胞发酵容器，替代传统不锈钢发酵罐，消除了日常清洗、消毒以及验证的需要，大大降低了传统罐的常见污染和交叉污染，同时大幅度减少了固定资产和操作成本投资。该系统安装方便，可快速投入工作，特别适用于临床用量较小的治疗性产品与诊断制剂的规模化制备。目前最大规模可达500L，最高细胞密度达6×10⁷ cells/ml，广泛适用于CHO、NS0、HEK293、杂交瘤、T细胞和初级人类细胞等。
Q6：动物细胞规模化瞬时表达系统的优势是什么？
瞬时表达系统为具有治疗价值的创新药靶筛选与评价提供了一种大规模蛋白表达的方式，包括前期DNA制备、细胞扩增、聚乙烯亚胺（PEI）介导的基因转染，在不到1个月时间即可获得大规模重组蛋白用于实验室研究和临床前产品研究，以及应急状态下的产品需求等。
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