大肠杆菌表达系统由宿主菌（即大肠杆菌）和表达载体构成。作为表达载体，首先必须满足克隆载体的基本要求，即具备复制能力、具有合适的酶切位点以及筛选标记，在这些基本骨架的基础上增加一些表达元件，能够将外源基因引入至大肠杆菌中。由于质粒适合于大量制备和体外操作，因此，几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用通过对天然质粒进行改造过的质粒作为运载外源基因的载体。这些作为表达载体的质粒大小一般在 2~50 kb 范围内，在通常条件下不会在宿主菌间发生转移，整合到染色体上的概率也较低，在遗传上具有较好的稳定性和安全性。

理想情况下，大肠杆菌表达载体具有以下特征：

pET 系列是 T7 驱动表达体系的经典代表。在大肠杆菌表达系统中，无论是抗原制备、结构生物学研究，还是工业级蛋白生产，它都是绕不开的选择。[reference:0]

核心原理：pET 载体上的目的基因由 T7 启动子驱动，T7 RNA 聚合酶具有极高的转录速率和极强的启动子专一性。IPTG 解除 LacI 对宿主菌染色体上 lacUV5 启动子的抑制，诱导宿主表达 T7 RNA 聚合酶；T7 聚合酶再识别 pET 上的 T7 启动子，启动目标基因高效转录。因此，pET 系统本质是"T7 聚合酶驱动的二级放大表达系统"，这种双层控制使得本底表达极低，适合表达对宿主有毒的蛋白。[reference:1]

pET 载体结构模块拆解：

• 多克隆位点（MCS）：提供多种限制性内切酶位点，用于插入目标基因。设计时要注意是否保留阅读框以及是否与标签融合。
• 融合标签系统：常见包括 6×His（Ni²⁺ 亲和纯化）、GST（提高可溶性）、MBP（强溶解增强）、Trx、SUMO、FLAG、S-tag。多数载体还带有 Thrombin、Enterokinase、Factor Xa 等蛋白酶切位点，便于后续去除标签。[reference:3]
• 抗性标记：主要为 Ampicillin 和 Kanamycin。实际生产中，Kan 因化学性质稳定更受青睐。[reference:4]
• 复制起点：多数为 pBR322 衍生 ori，中等拷贝数。pET 系统的高表达主要依赖 T7 聚合酶的高效转录，而非单纯追求高拷贝数。[reference:5]
• (+) 后缀：带有 (+) 的 pET 载体含有 f1 复制起点，可制备单链 DNA，适用于定点突变、测序等实验。[reference:6]

a/b/c/d 后缀的含义：a/b/c/d 提供不同的阅读框排列方式，目的是方便在不改变目标基因序列的情况下，与标签保持正确融合。并不是"某种型号更高级"，只是阅读框不同。克隆前务必核对载体图谱，确保插入基因的阅读框与标签一致。[reference:7]

pET-28a 载体特点：pET-28a-c(+) 载体带有一个 N 端的 His/Thrombin/T7 蛋白标签，同时含有一个可以选择的 C 端 His 标签。载体序列以 pBR322 质粒的编码规矩进行编码，T7 蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。T7 RNA 聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的 F1 复制子是被定向的，所以在 T7 噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白质表达，同时蛋白质表达将在 T7 终止子序列的作用下终止蛋白质翻译。

来自 GE Healthcare 的谷胱甘肽转移酶（GST）基因融合系统是一种表达、纯化和检测大肠杆菌中所产生的 GST 标签蛋白的多功能系统。系统包括三个主要成分：pGEX 质粒表达载体、GST 纯化的产品以及一系列 GST 检测产品。一系列切割 GST 标签的位点特异蛋白酶则是该系统的补充。GST 亲和标签实现了温和的纯化过程，不会影响蛋白质的天然结构和功能。

pGEX 载体的核心特点：

• ① 所有 pGEX 载体带有 tac 启动子，实现化学诱导的高水平表达；
• ② 温和、非变性的缓冲液成分，以分离活性蛋白；
• ③ 基于 Glutathione Sepharose™ 填料的亲和色谱产品实现了从微克到克规模样品的一步纯化；
• ④ 方便的预装柱形式适合单个样品或平行筛选多个重组克隆；
• ⑤ pGEX 载体上的 PreScission™ 蛋白酶、凝血酶或 Xa 因子识别位点能将目的蛋白从融合产物中切割下来；
• ⑥ 利用抗-GST 抗体轻松检测融合蛋白。

在天然情况下，GST 以分子质量为 26×10⁶ Da 的蛋白质形式存在，它在大肠杆菌中的表达产物具有完全的酶活。经过鉴定，pGEX 载体的重组日本血吸虫（Schistosoma japonicum）GST 的晶体结构与天然蛋白质一致。pGEX 质粒载体将基因或基因片段与 GST 融合后，在细胞内高水平诱导表达。重组蛋白很容易利用 Glutathione Sepharose 填料通过亲和色谱从大肠杆菌细胞裂解液中纯化。

用位点特异的蛋白酶，可实现目的蛋白与 GST 的切割，此蛋白酶的识别位点位于 pGEX 载体上多克隆位点的上游。GST 标签的切除是在柱中进行的，作为纯化步骤或纯化后离心的一部分。重组蛋白可利用 GST 检测模块中提供的免疫分析来检测，或用抗-GST 抗体在 Western Blotting 中检测，或通过比色分析来检测。

pGEX 载体家族：通过将一个基因或基因片段插入某个 pGEX 载体的多克隆位点，可构建出 GST 标签蛋白。载体提供了三种翻译读码框，从 EcoR I 限制性酶切位点开始。pGEX 载体是为基因或基因片段的高水平细胞内诱导表达而设计的。大肠杆菌中的表达产生了标签蛋白，GST 部分在氨基端，目的蛋白在羧基端。目前有 13 个 pGEX 载体；所有载体都有 tac 启动子，用于高水平的化学诱导表达，以及内部的 lacIq 基因，在任何大肠杆菌宿主中使用。

主要型号说明：

选择建议：

• 常规高表达：pET-28a(+) + BL21(DE3)，N 端 His 标签，Kan 抗性，操作简便。[reference:15]
• 蛋白易形成包涵体（难溶）：可选用含 GST、MBP、SUMO、Trx 等可溶性标签的载体，或使用 pCold 冷休克载体在低温下表达。[reference:16]
• 表达毒性蛋白：pBAD 系列，araBAD 启动子调控严谨，本底表达极低。[reference:17]
• 需要严谨调控：pET 系列 + pLysS 宿主菌，或 pBAD 系列。

近年来，原核表达载体领域出现了多项值得关注的新进展，为高通量构建和难溶蛋白表达提供了更多选择。