酵母双杂交，是研究蛋白质互作最经典、应用最广的技术之一。从文库构建到文库筛选，每一步的质控都直接影响最终结果的可靠性。钟鼎生物提供从构建杂交文库到文库筛选的一站式服务。本文即是我们与客户合作的案例分享，完整呈现了酵母双杂交文库构建到文库筛选的实验流程，并附有 RNA 电泳图、文库重组率、库容量鉴定、自激活检测、回转验证等关键结果图片，供大家参考。
- 文库构建流程图
- 文库构建服务案例：RNA提取与mRNA分离
- 初级文库构建与质量鉴定
- 次级文库构建与质量鉴定
- 文库筛选：诱饵载体构建与自激活检测
- 文库筛选：阳性克隆鉴定与回转验证
- 实验结论
- 常见问题解答（FAQ）
酵母双杂交文库构建是一个多步骤、多质控的流程，从 RNA 提取到最终可用于筛选的次级文库，每一步都需要严格的质量控制。
电泳检测完整性
质量与总量检测
adapter连接
电转化DH10B
电转化DH10B
自激活检测
核心质控点：① RNA 完整性——28S/18S 条带清晰；② mRNA 质量——总量满足文库要求；③ 初级文库——库容量＞107，重组率 100%；④ 次级文库——库容量＞107，重组率 100%，插入片段平均长度＞1000 bp；⑤ Bait 自激活检测——确认无自激活。
（限于篇幅，我们只选取了实验报告中部分步骤，如果需要了解更多的实验信息，请联系我们。）
RNA 电泳图如下：
使用 Oligotex mRNA Kits（Qiagen）分离纯化样本的 mRNA，mRNA 质量可以满足文库要求，mRNA 总量为 6.9 μg，电泳检测图片如下：
质控要点：RNA 电泳图中 28S 和 18S 条带清晰、比例合适，说明 RNA 完整性良好。mRNA 总量 6.9 μg，满足文库构建的起始量要求。
cDNA 合成与初级文库构建流程：
三份接头各连一份。
取转化后细菌原液 10 μL 稀释 1000 倍后，从中取出 50 μL 涂布 LB 平板（含相应抗性），37℃ 培养过夜第二天计数。
CFU/mL = 平板上的克隆数/50 μL × 1000倍 × 1×103 μL
文库总CFU = CFU/mL × 文库菌液总体积（mL）
随机挑取 24 个克隆进行菌落 PCR 鉴定，配制反应液，在 AB 2720 PCR 仪上进行 PCR 反应。结果如下图所示：
鉴定结果：重组率 = 24/24 × 100% = 100%；平均长度：>1000 bp。重组率计算公式：重组成功数量/克隆总数 × 100%。
初级文库库容量鉴定（库容量＞107）
将转化后原始文库菌液涂布氨苄抗性培养基平板扩增培养，第二天用液体培养基从平板上洗脱菌落，取其中 2/3 体积用 Qiagen 大抽试剂盒抽提质粒 DNA，剩余 1/3 体积中加入 25% 无菌甘油混合均匀后灌装保种管，冻存于 -80℃ 冰箱。
冻存于 -80℃ 冰箱内，可以保存 2 年以上，初级文库质粒可以用于次级文库构建，酵母双杂交初级文库菌的抗性为卡那霉素抗性。
取转化后细菌原液 10 μL 稀释 1000 倍后，从中取出 50 μL 涂布 LB 平板（含相应抗性），37℃ 培养过夜第二天计数。
CFU/mL = 平板上的克隆数/50 μL × 1000倍 × 1×103 μL
文库总CFU = CFU/mL × 文库菌液总体积（mL）
随机挑取 24 个克隆进行菌落 PCR 鉴定，配制反应液，在 AB 2720 PCR 仪上进行 PCR 反应。
鉴定结果：重组率 = 24/24 × 100% = 100%；平均长度：>1000 bp。
将转化后原始文库菌液涂布氨苄抗性培养基平板扩增培养，第二天用液体培养基从平板上洗脱菌落，取其中 2/3 体积用 Qiagen 大抽试剂盒抽提质粒 DNA，剩余 1/3 体积中加入 25% 无菌甘油混合均匀后灌装保种管，冻存于 -80℃ 冰箱。
冻存于 -80℃ 冰箱内，可以保存 2 年以上，次级文库可以直接用于酵母文库筛选，酵母双杂交次级文库菌的抗性为氨苄抗性。
次级文库库容量鉴定（库容量＞107）
一、试剂、耗材（略）仪器设备（略）试剂及配制（略）
二、诱饵载体构建 pGBKT7-Bait 的构建与鉴定（此步骤为常规的实验方法，可以通过酶切、测序等方法鉴定酵母杂交诱饵载体正确性，此处略）。
三、Bait 自激活检测
3.1 酵母转化反应
将各种质粒转入受体菌 Y2H 中，观察检测结果。
| Reaction | AD plasmid | BD plasmid | 涂板种类 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | pGADT7-largeT | pGBKT7-p53 | SD-TL | 阳性对照 |
| 2 | pGADT7-largeT | pGBKT7-laminC | SD-TL | 阴性对照 |
| 3 | pGADT7 | pGBKT7-Bait | SD-TL | 自激活检测 |
| 4 | - | pGBKT7-Bait | SD-T | 筛库备用 |
3.2 感受态酵母制备及酵母转化方法
将 YPDA 平板上的酵母，挑选一个菌斑，用 1 mL 移液枪全部吸取，置于 12 mL 摇菌管管装的 3 mL YPDA 培养基中；30℃，250 rpm 培养过夜。
室温下 700 g 离心 5 min，弃上清；用 40 mL 新鲜的 YPDA 培养基重悬；30℃，250 rpm 培养 3~5 h，至 OD600 至 0.4~0.5；室温下 700 g 离心 5 min，弃上清。
加入 30 mL 无菌去离子水重悬；室温下 700 g 离心 5 min，弃上清；用 1.5 mL 的 1.1× TE/LiAc 重悬，装至 2 mL 离心管；高速离心 15 s，弃上清；加入 1 mL 的 1.1× TE/LiAc 重悬，感受态细胞即制备完备，备用。
将 Bait 质粒 DNA 300 ng，变性鲑鱼精 DNA 5 μL，装在一个预冷的 1.5 mL 离心管中。加入 50 μL 感受态酵母，轻轻混匀，不要用枪吹打；加入 500 μL 的 PEG/LiAc，轻轻混匀，不要用枪吹打。
30℃ 水浴 30 min，每 10 min 轻轻混匀一次。加入 20 μL 的 DMSO，轻轻混匀。42℃ 水浴 15 min，每 5 min 轻轻混匀一次。
高速离心 15 s，去上清，加入 1 mL 的 YPD Plus 培养基重悬，震荡培养 90 min。高速离心 15 s，去上清，用 1 mL 的 0.9% NaCl 重悬。
3.3 Bait 自激活检测结果
pGBKT7-Bait + pGADT7 共转化 Y2H 长出的酵母转化子随机挑取了 6 个菌落进行自激活检测。包括 HIS3、ADE2、AUR1-C 和 MEL1 共 4 个报告基因的检测。
HIS3 和 ADE2 的检测采用点板培养的方法，将转化子点板至 SD-TLHA 平板，30℃ 恒温培养 4 天，观察其生长状态。
MEL1 报告基因的检测方法如下：
从转化平板随机挑取 6 个菌落于培养基上。
将滤纸完全浸于液氮中 90 s，取出常温放置 2 min 晾干。
在培养皿中加入新鲜配制的显色液，一般 9 cm 培养皿用 2-3 ml 显色液。将显色液加入培养皿中，再放入一张干净的滤纸，让其完全浸湿，将冻溶后的滤纸放在最上面，使显色液浸透表层，盖上皿盖。30℃ 避光培养，20 min 后开始观察，一般 2 h 后可开始看到颜色变化。4-5 h 拍照记录结果。
对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照可在 SD-TLHA 缺陷平板生长。pGBKT7-Bait + pGADT7 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长，生长状态同阴性对照，MEL1 检测中结果也与阴性对照相同，因此不存在自激活。
自激活检测结论：Bait 诱饵克隆没有自激活作用，可以用于后续文库筛选。
四、文库筛选
用含有正确 pGBKT7-Bait 诱饵质粒的 Y2H 酵母转化子作为受体菌制备感受态，将次级文库质粒转入其中，涂 SD/-Trp/-Leu/-His 平板。
五、影印清除
为了消除背景生长菌落的干扰，在培养到第 3 天时，用绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养 7-14 天。分批挑取再次长出的转化子菌落进行下一步检测。
六、阳性克隆鉴定
至影印清除后继续培养 7-14 天，从筛库平板中挑取长出的阳性克隆单菌落，共挑取到 20 个初始阳性克隆转化子转接到 SD-TL 缺陷型平板中继续培养 2-3 天。
6.1 阳性克隆 His 和 Ade 报告基因的检测
将上述 SD-TL 缺陷型平板上长出的 20 个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至 SD-TL 和 SD-TLHA 缺陷平板，30℃ 恒温培养 3-4 天，结果如下图所示：
阳性克隆检测结果显示：在 20 个初始阳性克隆中，有 13 个能在 SD-TLHA 生长的是激活了 ADE2 和 HIS3 报告基因。
6.2 阳性克隆 LacZ 报告基因检测
将 20 个初始阳性克隆用无菌水重悬后点于培养基上进行 MEL1 报告基因检测。
七、酵母阳性克隆 DNA 提取和测序比对
通过测序比对，可以将重复的阳性克隆子去除，本实验案例中，有多个克隆子为重复的阳性克隆，经过筛除后，我们可以确认获得了 6 个完全不同的阳性克隆子。
八、回转验证
用含有正确 pGBKT7-Bait 诱饵质粒的 Y2H 酵母转化子作为受体菌制备感受态，将 6 种阳性克隆质粒 DNA 分别转化其中，分别回转验证 His 和 Ade 报告基因的检测和 MEL1 报告基因检测。
本项目以 Bait 基因 cDNA 克隆为诱饵，筛选 cDNA 酵母双杂交文库，在筛选到的 20 个初始阳性中，经过鉴定结果显示有 13 个能激活 ADE2、HIS3 和 LacZ 报告基因。经过对这些阳性克隆质粒进行 DNA 测序和 BLAST 比对分析，结果表明它们分别属于 6 种不同蛋白的编码基因。
通过对这 6 种阳性克隆的回转验证检测，结果显示所有阳性克隆都能通过对 ADE2、HIS3 和 LacZ 报告基因的回转验证。
结果小结：20 个初始阳性 → 13 个激活报告基因 → 6 个不同阳性克隆 → 回转验证全部通过。整个流程从文库构建到筛选验证，每一步都有严格的质控，确保最终结果的可靠性。
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