比大肠杆菌“高级”，比哺乳动物“省钱”，酵母表达系统真有那么香？

做重组蛋白的你，是否总在“原核快但没修饰”和“哺乳动物好但贵又慢”之间反复纠结？其实，还有一个被无数实验室验证过的“中间派”——酵母表达系统。它兼具真核生物的修饰能力与微生物的便捷操作，从基础研究到生物药开发，堪称“全能型选手”。今天，我们就来聊聊它的真实实力，以及我们如何让它变得更强。

为什么酵母是“性价比之王”？

在重组蛋白表达的世界里，选择往往意味着妥协：

大肠杆菌：简单高效，但缺乏翻译后修饰，包涵体问题让人头疼。
哺乳动物细胞：功能完备，但周期长、成本高，不是每个课题组都烧得起。

而毕赤酵母，恰好站在了十字路口的黄金位置——既能像微生物一样快速生长、高密度发酵，又能实现真核水平的蛋白折叠与修饰。正因如此，它已成为重组亚单位疫苗、抗体片段、细胞因子等生物药开发的主力平台之一。

三大优势，让酵母脱颖而出

优势1：分泌表达

毕赤酵母的分泌表达成功率约为80%左右，远高于大肠杆菌（低于10%）。另一方面，毕赤酵母发酵液上清的杂蛋白较少（见图1A），因此亲和层析纯化的成功率极高（超过95%，不会出现大肠杆菌中“能表达但不能挂柱”的情况），易于获得纯化蛋白进行下游实验。如果涉及高通量的蛋白筛选（如突变体文库），毕赤酵母发酵液上清经过滤除菌后即可上细胞进行功能验证，可省略大部分实验室阶段的各种蛋白纯化工作。最后，如果重组蛋白具有较高的应用价值，发酵液上清的纯化工艺既简单又廉价，有利于推动其工业化应用。

优势2：产量优化

菌种改造及高密度发酵优化是提高重组蛋白产量的关键环节。一般而言未经优化的酵母表达产量大概率低于大肠杆菌，但通过使用高效表达元件、提高目的基因拷贝数、共表达分子伴侣后，重组蛋白的产量可比优化前提高3-8倍。然后使用高密度发酵技术，对温度、供氧、补料等参数进行优化又可在此基础上继续提高8-10倍。最终将重组蛋白产量提高至理想水平。

图1 多拷贝策略对犬α干扰素产量的影响

(A) 摇瓶发酵上清的SDS-PAGE检测。泳道M：蛋白质分子量标记；泳道1-5：1、2、4、6、8拷贝酵母转化子发酵液上清。4泳道对应的摇瓶表达量可达350 mg/L左右。
(B) 6拷贝酵母转化子的高密度发酵。红色圆点：目的蛋白含量；蓝色方块：菌体湿重。重组蛋白产量可达1.26 g/L水平

优势3：“可溶即正确”

传统观念认为“蛋白可溶即折叠正确”，这是一种略显片面的经验性判断，尤其不适用于大肠杆菌生产的重组蛋白。如图2所示，天然蛋白会将疏水基团包裹在蛋白内部，使整个蛋白处于亲水状态，整体表现为可溶；而错误折叠的重组蛋白即便未形成正确的空间构象，仍有可能借助自身某些高亲水性的基团或亚基阻止蛋白聚集、蛋白沉淀的发生，从而表现为可溶。显然后者无法与其它蛋白发生正常互作。毕赤酵母是真核宿主，具有完善的蛋白重折叠系统及质量控制系统（二者主要存在于分泌通路上），当重组蛋白发生错误折叠时，内质网中的分子伴侣可与暴露的疏水片段结合，进而将其靶向至重折叠途径或降解途径。基于此酵母细胞保证了每一个分泌到培养基中的蛋白分子都处于“正确”折叠的状态，进而保证其具有正常的生物活性。该现象可描述为“分泌即可溶，且正确折叠”。

图2 蛋白折叠与可溶性的因果关系示意图

螺旋表示正确折叠的蛋白亚基，曲线表示错误折叠的蛋白亚基。红色表示亲水性较高，绿色表示亲水性较弱，黑色表示疏水性较强。剪刀表示蛋白水解酶。

尽管毕赤酵母在蛋白产量、可溶性等方面具有显著优势，但该系统仍面临若干挑战，当然，也有相对应的优化方案。

挑战1：糖基化可能影响活性

首先，糖基化侧链具有较高的亲水性，可能"遮蔽"附近疏水区域，从而提高蛋白溶解度；另一方面，糖基侧链也可能提供合适的空间位阻，形成正确的活性中心或暴露关键位点。但毕赤酵母也可能发生过糖基化现象,比如下图3——猪瘟病毒E2蛋白（已截短）和植酸酶App均含3个N-糖基化位点，电泳结果却显示蛋白条带偏移量与其N-糖基化位点数目不成线性正相关，提示过长糖链可能干扰蛋白正常互作。

图3 酵母过糖基化(A)与正常糖基化(B)的比较

(A)：毕赤酵母分泌表达的猪瘟病毒E2蛋白。泳道1：浓缩纯化后的E2蛋白；泳道2：Endo Hf处理的E2蛋白。黑色箭头：Endo Hf；蓝色箭头：去糖基化的E2蛋白。
(B)：毕赤酵母分泌表达的植酸酶App蛋白。泳道1：纯化后的App蛋白；泳道2：PNGase F处理的App蛋白。红色箭头：PNGase F；黄色箭头：去糖基化的App蛋白。

优化方案：

①不去除蛋白序列时，使用 Endo Hf / PNGase F 去糖基化；
②使用 糖基化改造菌株（如SuperMan5），获得人源化程度更高的糖型；
③允许突变时，可构建无糖基化突变体（注意仍有O-糖基化）；
④必要时，我们还会评估糖基化对蛋白互作的正向作用，“扬长避短”。

挑战2：不是所有蛋白都可在毕赤酵母中实现分泌表达

一般而言，二硫键配对简单、分子量较小的单体（非聚体）蛋白较易实现分泌表达，其产量也较高。比如犬α干扰素（图4A）的分泌表达产量高于猪瘟病毒E2蛋白（已截短，图4B）。而对膜蛋白而言，单次跨膜和多次跨膜蛋白的表达情况有所不同。首先，单次跨膜蛋白的胞外区是可以单独进行分泌表达的（图4C）；其次，β折叠桶形状的跨膜通道蛋白无论是否截短都无法分泌表达（图4D）；最后，以α螺旋为主要二级结构的跨膜蛋白有极低可能实现全长的分泌表达（图4E）。简言之膜蛋白截短表达的前提是有像棒棒糖一样“独立”的胞外区。如果将不独立的某个区域单独表达，其由于缺乏空间支撑而不能进一步形成正确的空间构象，最终大概率会被靶向至水解途径而无法分泌。

图4 不同蛋白的空间结构模型

(A)：犬α干扰素；(B)：猪瘟病毒E2蛋白胞外区；(C)：猪瘟病毒E2蛋白全长；(D)：以β折叠为主要二级结构的通道蛋白；(E)：以α螺旋为主要二级结构的膜受体蛋白。

优化方案

针对“难表达”蛋白，我们会通过信号肽筛选、融合标签、截短设计、共表达伴侣等策略，最大限度提高分泌成功率。对于实在无法分泌的靶点，我们也会建议转向胞内表达或其他宿主系统——不盲目承诺，只提供最优方案。

综上所述。酵母表达系统并非“完美”，但它用实力证明了什么是“够用且好用”。

我们致力于让它的优势更突出、短板可弥补，帮您更快、更稳、更省地拿到高质量重组蛋白。

参考文献 [1] D. Li, H. Zhang, L. Yang, J. Chen, Y. Zhang, X. Yu, Q. Zheng, J. Hou, Surface display of classical swine fever virus E2 glycoprotein on gram-positive enhancer matrix (GEM) particles via the SpyTag/SpyCatcher system. Protein expression and purification 167 (2020) 105526.
[2] C. Li, Y. Lin, X. Zheng, N. Pang, X. Liao, X. Liu, Y. Huang, S. Liang, Combined strategies for improving expression of Citrobacter amalonaticus phytase in Pichia pastoris. Bmc Biotechnology 15 (2015) 1-11.
[3] H. Zhao, K. Blazanovic, Y. Choi, C. Bailey-Kellogg, K.E.J.A. Griswold, e. microbiology, Gene and protein sequence optimization for high-level production of fully active and aglycosylated lysostaphin in Pichia pastoris. 80 (2014) 2746.
[4] A.H. Keeble, A. Banerjee, M.P. Ferla, S.C. Reddington, I.N.K. Anuar, M.J.A.C.I.E. Howarth, Evolving accelerated amidation by SpyTag/SpyCatcher to analyze membrane dynamics. 56 (2017) 16521-16525.

案例分享

酵母电转化

图1 转化平板图（MD）

表型的确认

图2 MD平板

图3 MM平板

PCR鉴定

图4 PCR分析阳性克隆

M：从上到下10000 bp，5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp；
1-10: 阳性菌株11# - 20#；
PC: 阳性对照（质粒）；
NC：阴性对照

WB鉴定分析

图5 蛋白表达鉴定WB分析

M：蛋白标准品
1：GS115菌株培养72小时分泌上清
2：14 #阳性菌株培养72小时分泌上清
3：14 #阳性菌株培养96小时分泌上清
4：16 #阳性菌株培养72小时分泌上清
5：16 #阳性菌株培养96小时分泌上清
6：17 #阳性菌株培养72小时分泌上清
7：17 #阳性菌株培养96小时分泌上清
8：阳性蛋白（His标签m.w.=96KD）

SDS-PAGE结果分析

图6 蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析

M：蛋白标准品
1：GS115菌株培养72小时分泌上清
2：14 #阳性菌株培养72小时分泌上清
3：14 #阳性菌株培养96小时分泌上清
4：16 #阳性菌株培养72小时分泌上清
5：16 #阳性菌株培养96小时分泌上清
6：17 #阳性菌株培养72小时分泌上清
7：17 #阳性菌株培养96小时分泌上清
8：19 #阳性菌株培养72小时分泌上清
9：19 #阳性菌株培养96小时分泌上清

图7 蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析

M：蛋白标准品
1：GS115菌株培养72小时裂解上清
2：14 #阳性菌株培养72小时裂解上清
3：14 #阳性菌株培养96小时裂解上清
4：16 #阳性菌株培养72小时裂解上清
5：16 #阳性菌株培养96小时裂解上清
6：17 #阳性菌株培养72小时裂解上清
7：17 #阳性菌株培养96小时裂解上清
8：19 #阳性菌株培养72小时裂解上清
9：19 #阳性菌株培养96小时裂解上清

纯化结果分析

通过Ni柱亲和纯化后进行12% SDS-PAGE分析结果如下：

图8 蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析

M：蛋白标准品
1：14#阳性菌株培养96小时分泌上清
2：过柱流出液
3-9：过柱洗脱液

图9 蛋白纯化SDS-PAGE分析

M：蛋白标准品
1：纯化后样品
2：0.5 mg/mL BSA

图10 蛋白Western Blot鉴定分析

M：蛋白标准品
1：纯化后样品

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