随着分子生物学的发展，分子生物学技术在真菌学研究中得到了广泛而深入的应用。一些因形态复杂、生理生化不稳定等原因导致分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种，通过该技术得到了验证。
其中，核糖体rDNA ITS序列是目前真菌鉴定中应用最广泛的分子标记之一。本文系统梳理ITS的结构特征、在真菌分子系统学与病原学研究中的应用，供科研工作者参考。
本文内容速览：
- 一、ITS序列特征——rDNA基因簇的结构与功能
- 二、ITS序列在真菌分子系统学研究中的应用
- 三、ITS序列在真菌病原学研究中的应用
- 四、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、ITS序列特征——rDNA基因簇的结构与功能
目前，真菌核酸序列研究几乎都集中在rRNA基因上。因为rDNA存在广泛的保守区域，可以用作引物的结合位点；同时，不同区域客观存在的进化水平差异，使其可以用于不同分类等级的研究。用于扩增rDNA不同区域的保守引物已设计成功，并广泛用于菌物系统发育研究中。
ITS（内转录间隔区）位于18S和5.8S rDNA之间（ITSl）以及5.8S和28S rDNA之间（ITS2）。在18S rDNA基因上游和28S rDNA基因下游还有外转录间隔区ETS。ITS和ETS区的转录物均在rRNA成熟过程中被降解。
ITS和ETS包含有rDNA前体加工的信息，在rRNA成熟过程中有着相当重要的作用。非转录区又称基因间隔区IGS，它将相邻的两个重复单位隔开，在转录时有启动和识别作用。
结构要点：整个rDNA基因簇从5'到3'端依次为——基因间隔区IGS（包括18S rDNA基因上游的ETS1和28S rDNA基因下游的ETS2）→ 位置可变的5S rDNA基因 → 18S rDNA基因 → ITS1序列 → 5.8S rDNA基因 → ITS2序列 → 28S rDNA基因。
PART 02二、ITS序列在真菌分子系统学研究中的应用
18S、5.8S、28S rDNA基因序列进化缓慢而相对保守，但这三个基因序列之间的ITS序列的进化则相当迅速，因而rDNA序列广泛用于真菌各级水平的系统学研究。
| 区域 | 大小 | 进化速率 | 系统学应用 |
|---|---|---|---|
| 18S rDNA | 约1.8 kb | 较慢（比28S更保守） | 种级以上阶元的良好标记 |
| 28S rDNA | 约3.4 kb | 较慢 | 种级以上阶元系统发育分析 |
| 5.8S rDNA | 分子量小 | 高度保守 | 较少用于系统学研究，但为通用引物设计提供便利 |
| ITS1 / ITS2 | 1000 bp到小于300 bp不等 | 较快 | 属内种间或种内群体的系统学研究 |
由于ITS区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长度为1000 bp到小于300 bp大小不等，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究。
方法概览：目前使用ITS区作为分子标记的主要方法有两种——DNA序列测定分析与PCR-RFLP分析。两者常配合使用，前者提供直接的序列信息，后者提供快速的酶切图谱指纹。
案例1｜酵母属间分子进化分析：Belloch等使用ITS序列测定分析技术，分析了分别属于Kluyveromyces aestuarii、K. dobzhanskii、K. lactis、K. marxianus、K. nonfermentans和K. wickerhamii六个种的39个菌株，研究其分子进化关系。在分子水平上鉴别了K. lactis的两个变种——K. lactis var. lactis（乳糖阳性，主要分离自乳制品）和K. lactis var. drosophilarum（乳糖阴性，由昆虫和植物分泌物中分离得到）。结果表明，目前认为的K. lactis实际上是一个包含不同种、亚种的复合菌群。
案例2｜皮肤癣菌属系统学研究：Trichophyton是一类能侵入角质化组织并引起癣病的真菌，共有40多个种。人们曾使用基因组DNA的G+C含量、线粒体DNA的RFLP分析以及18S、28S rDNA序列比较等方法对其进行研究，但仍有部分种难以鉴定。Graoser等使用ITS1和ITS2两个区间的序列成功地研究了该属的53株菌，结果将它们分别归为38个种，并通过形态学及生理生化特征证实了ITS序列分析的可行性。
案例3｜酵母菌种水平区分：Chen等应用ITS序列对来自40个种的141株酵母真菌进行了分子系统学研究。通过自动毛细管电泳对菌株ITS序列PCR产物的分析发现：ITS-1区序列长度多态性可将菌株分为19个种；ITS-2区序列长度多态性分为16个种；ITS全序列长度多态性分为30个种；进一步通过ITS-1序列测序分析则可准确分为40个种。
捕食线虫真菌系统发育：祝明亮等利用PCR-RFLP方法对捕食线虫真菌节丛孢属、隔指孢属进行了系统发育研究，结果体现了属内不同种间的亲缘关系，从分子水平证实了节丛孢属、隔指孢属形态分类学的合理性。
木霉属"集合种"研究：章初龙等对来源不同的T. harzianum及其相似种的46个菌株进行了ITS序列测定，结果表明T. harzianum及其相似种可分成A、B 2个群：A群由T. hamatum、T. asperellum、T. atroviride、T. koningii和T. viride组成，并形成2个分支；B群由T. spirale、T. inhamatum、T. harzianum、T. hamatum和T. afroharzianum组成，并形成6个分支。
拟茎点霉属系统发育：陈永青等采用随机扩增多态性技术和核糖体基因rDNA转录间隔区ITS序列分析，对22种拟茎点霉共34个菌株进行了系统发育研究，可以清楚地将分自7科寄主植物上的不同的种分别区分开来。
PART 03三、ITS序列在真菌病原学研究中的应用
近年来，新药的临床应用迫切要求发展新的病原真菌鉴定手段——在最短的时间里将致病菌鉴定到种的水平，以选择敏感有效的药物进行治疗。ITS序列分析技术由于快速、简便和高特异性，显示出了极大的优势。
面部深层感染鉴定：Trotha等使用ITS序列分析方法，成功地从一位面部深层感染而引起脓肿溃疡的患者身上鉴定出了病原真菌Trichophyton interdigitale，从而通过新的抗生素联合疗法使此前由于未能准确找出病原菌而导致的感染扩散顺利解决，患者得到治愈。
隐球菌重新分类：Sugita等使用ITS序列分析方法重新鉴定了Cryptococcus albidus的19个菌株，其中包括9株临床分离物。结果将19个菌株分为C. albidus和C. diffluens两个种，其中一个分离自一位AIDS病患者血液的菌株被认为是一个新种，它的生化特征与C. albidus和C. diffluens的区别极为微小。
组织胞浆菌分子流行病学：Tamura等对分离自两位患者体内的两个Histoplasma capsulatum菌株与来自其他地域的30个H. capsulatum参考菌株一起进行了分子流行病学研究。RAPD分析显示两个临床菌株的带型与参考菌株一致；随后采用ITS序列分析方法，将32个菌株分为8组——分别为亚洲型、南美洲型A、南美洲型B、北美洲型1、北美洲型2、H. duboisii A、H. duboisii B和东亚型，而两个临床菌株属于东亚型。
反向杂交检测法：Martin等近来发展了一种排列探针逆杂交检测法（Reverse-Hybridization line assay），在ITS-PCR的基础上，检测出了大量重要的Candida属致病真菌，其灵敏度达到检测样品最低浓度2–10个细胞/毫升。
分子信标技术：分子信标（Molecular beacons）是一种小的核酸发夹环状探针，当其特异地与标靶序列结合时能够产生明亮的荧光。Park等使用基于ITS2序列的种特异性分子信标快速鉴定了C. albicans和C. dubliniensis的23个菌株，准确率达100%。
国内念珠菌快速检测：王英等采用两对内转录间隔区ITS的种特异性引物和通用引物对念珠菌悬浮液进行扩增，结果发现采用通用引物结合快速检测法可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌，并能同时鉴定到种，对念珠菌病的早期诊断和治疗有潜在的应用价值。彭慧等采用PCR-RFLP方法对10个菌株的ITS序列进行分析，证实了标准菌株的ITS序列酶切图谱可供快速、准确地鉴定尖端赛多孢子菌，便于临床早期诊断。
应用价值总结：ITS序列分析技术在病原真菌鉴定中，将"形态学+生理生化"传统鉴定模式升级为"分子序列"鉴定模式，鉴定周期从数周缩短至数天，且可鉴定到种的水平，为临床早期精准用药提供依据。
FAQ四、常见问题解答
Q1：什么是ITS序列，为什么能用于真菌鉴定？
ITS（内转录间隔区）位于18S和5.8S rDNA之间（ITS1）以及5.8S和28S rDNA之间（ITS2）。由于ITS区不加入成熟核糖体，受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性，且长度适中，因此广泛用于真菌属内种间或种内群体的系统学研究。
Q2：ITS序列和16S rDNA分别适用于什么场景？
16S rDNA主要用于细菌鉴定，ITS序列主要用于真菌鉴定。二者是不同生物类群的两套分子标记，互补使用可覆盖细菌与真菌的菌种鉴定需求。
Q3：ITS序列分析的主要方法有哪些？
目前使用ITS区作为分子标记的主要方法有DNA序列测定分析和PCR-RFLP分析两种。前者直接获取序列信息，后者通过限制性酶切图谱进行种间区分，二者常配合使用。
Q4：18S、5.8S、28S rDNA在进化速率上有什么差异？
18S、5.8S、28S rDNA基因序列进化缓慢而相对保守。其中18S比28S基因更保守，是在系统发育中种级以上阶元的良好标记；5.8S基因分子量小且高度保守，较少用于系统学研究，但它为真菌rDNA PCR扩增的通用引物设计提供了极大的方便。
Q5：ITS序列在临床病原真菌鉴定中有哪些应用？
ITS序列分析技术由于快速、简便和高特异性，在病原真菌鉴定中优势明显。例如：从患者面部深层感染组织中鉴定出Trichophyton interdigitale；重新鉴定Cryptococcus albidus临床分离物；对Histoplasma capsulatum临床菌株进行分子流行病学分析等。此外，基于ITS2序列的分子信标技术可快速鉴定C. albicans和C. dubliniensis，准确率可达100%。
- Belloch C, et al. Phylogenetic relationships among Kluyveromyces species. Int J Syst Bacteriol.
- Graoser Y, et al. Molecular taxonomy of Trichophyton species based on ITS sequences.
- Chen YC, et al. Molecular systematics of yeast species by ITS sequence analysis.
- Muyzer G, et al. Profiling of complex microbial populations by DGGE analysis of 16S rRNA. Appl Environ Microbiol, 1993.
- 祝明亮等. 捕食线虫真菌节丛孢属、隔指孢属的系统发育研究.
- 章初龙等. 木霉属T. harzianum及其相似种的ITS序列分析.
- 陈永青等. 拟茎点霉属ITS序列与RAPD系统发育研究.
猜您想看：
- 菌种鉴定服务案例：真实项目案例展示，看菌种鉴定如何落地。
- 菌种鉴定常见问题：样品要求、结果判读、误差来源解析
- 16S rDNA提取与检测方法：总DNA提取与琼脂糖凝胶电泳检测的完整操作步骤与关键参数。
- 16S rDNA & 16S rRNA：两者的区别、联系，以及在不同实验场景中如何选择。
- 细菌16S rDNA常见问题解析：7步鉴定方法、试剂配制清单与实验避坑指南。
相关服务
联系我们
 |
南京栖霞区红枫科技园 A6 栋 2 层 |
 |
E-mail：order@zoonbio.com |
 |
技术热线电话：400-066-8086 |
 |
025-85634800 025-85454800 025-85774800 025-84448440 |