16S rDNA是细菌分类鉴定最常用的分子标记，也是微生物多样性研究的基石。而整个鉴定流程能否走通，几乎完全取决于最前面的两步——样品总DNA提取得够不够纯，以及提取出来的DNA有没有被降解。
本文把这两步的完整操作拆开讲清楚：每一步加什么试剂、用什么转速、多长时间，以及容易翻车的地方在哪里。文末附参数速查表和常见问题解答，可直接对照实验台使用。
本文内容速览：
- 一、样品总DNA的提取（细胞破碎 → 酚-氯仿抽提 → 乙醇沉淀）
- 二、DNA的检测——1.2%琼脂糖凝胶电泳
- 三、关键参数速查表
- 四、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、样品总DNA的提取
本方法采用锆珠机械破碎 + 酚-氯仿抽提 + 乙醇沉淀的经典路线，适用于细菌培养物、土壤、肠道内容物等各类样品的总DNA制备。
称取 0.5 g 样品，装入含 0.3 g 锆珠的已灭菌 screw-capped tube 中；加入 1 mL TN150 和 150 µL 酸性酚，使用 bead-beater 匀浆（5000 rpm，3 min）；随后置于冰上冷却，加入 150 µL 氯仿/异戊醇，涡旋混匀，10000 rpm 离心 5 min；转移上清液至已灭菌的 eppendorf 管。
向上述 eppendorf 管中加入 150 µL 氯仿/异戊醇 和 150 µL TE 饱和酚，涡旋混匀 1 min，10000 rpm 离心 1 min，上清移入新的灭菌 eppendorf 管。重复该步骤直至水相之间的界面清晰为止。
随后加入 300 µL 氯仿/异戊醇，10000 rpm 离心 1 min，上清移入新的灭菌 eppendorf 管。
加入 96% 冷乙醇 1 mL 和 50 µL 3 M NaAc（pH=5.2），-20℃ 沉淀 DNA 过夜。次日 10000 rpm 离心 20 min，弃上清；加入 500 µL 70% 冷乙醇洗涤沉淀，10000 rpm 离心 5 min，弃上清。风干沉淀后，加入 50 µL TE 缓冲液溶解 DNA，-20℃ 保存。
- 酚是致癌物质，实验操作应佩戴手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。
- 实验中使用了挥发性有毒物质，所有操作应在通风橱中进行。
- 实验过程中样品应始终放置于冰面上，所有离心操作在 4℃ 下进行。
PART 02二、DNA的检测——琼脂糖凝胶电泳
提取完成后必须对DNA进行质检。琼脂糖凝胶电泳是最直接、成本最低的检测手段，可判断DNA的完整性、片段大小与大致浓度。
- 用胶带纸将洗净、干燥的电泳凝胶床两端开口封好，形成一个胶模，水平放置在工作台面上；插入样品梳，梳齿与底面相距 0.5–1 mm。
- 称取 1.2 g 琼脂糖置于小锥形瓶中，加入 100 mL 1×TAE 稀释缓冲液，加热直至琼脂糖完全溶解（呈透明溶化液）。
- 待冷却至 60℃ 后（戴手套操作），小心加入 5 µL EB 染色贮存液，摇匀。
- 将琼脂糖倒入胶模中，倒胶时避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。
- 待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出样品梳。
- 取下封边的胶带纸，移入电泳槽，倒入电泳缓冲液直至浸没凝胶面 2–3 mm。
用微量加样器或可调枪，依次将所提取 DNA 与加样缓冲液（loading buffer）按 5 : 1 混合后点入加样孔内。
恒压 100 V 电泳 15–20 分钟。
将凝胶置于紫外检测仪下观察并拍照记录。
- 溴化乙锭（EB）是诱变剂，配置和使用时应戴手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上；凡被其沾污的地方必须专门处理后才可进行清洗和消毒。
- 加样量取决于加样槽大小，加入样品体积应略小于加样槽体积。
- 紫外观测时避免紫外灯对眼睛的伤害，务必佩戴防护面罩。
结果判读要点：条带单一、明亮、无拖尾，说明DNA完整度良好，可直接进入下游PCR扩增；若条带弥散或呈拖尾状，提示DNA已降解；若加样孔附近出现明亮滞留带，则多为蛋白或多糖残留，需增加抽提次数或重新沉淀。
速查三、关键参数速查表
| 阶段 | 关键操作 | 关键参数 |
|---|---|---|
| 细胞破碎 | 锆珠 + bead-beater 匀浆 | 0.5 g 样品 + 0.3 g 锆珠 + 1 mL TN150；5000 rpm，3 min |
| 酚-氯仿抽提 | 氯仿/异戊醇 + TE 饱和酚反复抽提 | 各 150 µL；涡旋 1 min；10000 rpm，1 min |
| 乙醇沉淀 | 96% 冷乙醇 + 3 M NaAc | 1 mL 乙醇 + 50 µL NaAc（pH 5.2）；-20℃ 过夜 |
| 沉淀回收与洗涤 | 离心收集沉淀，70% 冷乙醇洗涤 | 10000 rpm，20 min；洗涤后 10000 rpm，5 min |
| 溶解与保存 | TE 缓冲液溶解 | 50 µL TE；-20℃ 保存 |
| 凝胶制备 | 1.2% 琼脂糖凝胶 | 1.2 g 琼脂糖 + 100 mL 1×TAE；60℃ 加 5 µL EB |
| 电泳检测 | 点样后恒压电泳，紫外观察 | DNA : loading buffer = 5 : 1；100 V，15–20 min |
FAQ四、常见问题解答
Q1：16S rDNA 鉴定需要多少样品量？
本方法称取 0.5 g 样品即可完成总 DNA 提取。对于纯培养菌体，通常一个单菌落或少量菌体沉淀已足够；对于环境样品（土壤、肠道内容物等），建议 0.2–0.5 g。样品量过低会导致 DNA 得率不足，过高则容易引入腐殖酸、多糖等 PCR 抑制物。
Q2：为什么提取完 DNA 一定要做琼脂糖凝胶电泳检测？
电泳可以直观判断三件事：一是 DNA 是否完整（条带是否清晰、有无降解拖尾），二是 DNA 的片段大小与浓度水平，三是样品中是否残留蛋白、多糖或 RNA。只有质检合格的 DNA，后续 16S rDNA 的 PCR 扩增和测序才能稳定出结果。
Q3：电泳条带拖尾或弥散说明什么？
条带弥散、拖尾通常提示 DNA 发生降解，常见原因包括样品反复冻融、裂解过于剧烈、核酸酶污染或提取过程中未全程低温操作。若加样孔附近出现明亮滞留带，则多为蛋白或多糖残留，需要增加酚-氯仿抽提次数或延长沉淀时间。
Q4：酚-氯仿法提取 DNA 时为什么要用冷乙醇和 NaAc？
NaAc（pH 5.2）提供酸性高盐环境，中和 DNA 骨架上的负电荷，使 DNA 分子间能够聚集；冷乙醇（96%，-20℃ 预冷）进一步降低 DNA 溶解度，促使 DNA 形成絮状沉淀析出。两者配合可在 -20℃ 过夜沉淀中最大程度回收 DNA。
Q5：提取的 DNA 可以保存多久？
TE 缓冲液溶解后的 DNA 建议分装保存于 -20℃，短期（数周至数月）使用可放 4℃，长期保存建议 -80℃。避免反复冻融，每次取用后立即放回，否则会造成 DNA 断裂和降解。
- 《分子克隆实验指南》（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）——酚-氯仿抽提与乙醇沉淀标准流程。
- 《精编分子生物学实验指南》——细菌基因组 DNA 制备与琼脂糖凝胶电泳检测。
- 16S rRNA 基因在细菌系统发育分析与菌种鉴定中的应用综述。
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