一、仪器和试剂耗材

1、仪器：Biacore
2、试剂与耗材：CM5 Sensor 、氨基偶联试剂盒、醋酸钠缓冲溶液（pH4.0/pH4.5/pH5.0）、10x PBS-P+、96 孔板、96 孔板封口膜。

二、SPR 实验原理简介

Biacore 系统基于表面等离子共振技术（SPR），实时记录分子结合和解离过程中传感芯片表面分子质量发生的变化，从而实时地监测分子间的相互作用。为了研究两个分子之间的相互作用，其中一个分子被固定到芯片表面上（Ligand），而另一个分子（analyte）以溶液的形式连续流过芯片表面，检测器能实时检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离过程，并以 SPR 响应值的形式显示。

1、全内反射的条件下，入射光造成薄金层等离子体发生共振，导致反射光在某一特定角度（SPR 角）能量低至几乎为零。

2、SPR 角对金膜溶液测 100-200 nm 范围内的折光率变化非常灵敏。

3、分子间可逆的结合/解离造成金膜附近折光率的实时变化，这一现象被Biacore 实时记录。

4、Biacore 类似一个高精度的光学天平，通过 SPR 原理放大信号，能检测芯片表面 1pg/mm2 的物质变化。

将蛋白氨基偶联到芯片上后，分析物小分子注射到芯片表面和蛋白结合产生结合信号，停止注射后从小分子从芯片解离，信号回到基线。

三、实验流程

1、实验样品

（1）蛋白样品

名称	分子量	规格
蛋白 A	50 kDa	0.5mg/mL*1 mL

（2）待测物样品

名称	分子量	规格
小分子 B	530.34	0.5mg*2

2、实验方法

拟采用氨基偶联法进行蛋白固定；
蛋白偶联缓冲溶液：1.0×PBS-P+（pH7.4）
互作缓冲溶液：1.0×PBS-P+（pH 7.4），5% (v/v) DMSO

2.1 蛋白偶联

(1) 将运行缓冲液 (200 mL 1×PBS Buffer)、水瓶、废液瓶分别放置在左右托盘中，并插入相应的进液管。
(2) 手持 CM5 芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入卡槽，最后合上芯片舱的舱门。
(3) 用 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺 (EDC，Cytiva) 和 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS，Cytiva) 以 10 μL/min 的流速激活芯片 4 号通道。
(4) 将配体蛋白用醋酸钠稀释至 200 μg/mL，以 10 μL/min 的流速将蛋白固定在芯片的 4 通道，生成偶联图。
(5) 用乙醇胺以 10 μL/min 的流速封闭通道。

2.2 蛋白与待测物相互作用测试

(1)溶剂校正：

待测物的运行缓冲液选用含 5% DMSO 的 1×PBS-P+，将系统左侧托盘中的原运行缓冲液换成含 5% DMSO 的 1×PBS-P+，并插入相应的进液管。按照下表混合 4.5% 和 5.8% 母液配置 5% DMSO 浓度校正曲线：

Buffer/Vial	1	2	3	4	5	6	7	8
4.5%DMSO (μL)	0	200	400	600	800	1000	1200	1400
5.8%DMSO (μL)	1400	1200	1000	800	600	4000	200	0

(2)待测物测定：

每个待测物在 96 孔板内稀释成若干浓度，通过芯片从低浓度到高浓度与目标蛋白偶联。流速为30μL/min，持续时间为360s。
每个浓度点流过后，用 10 mM 甘氨酸盐酸盐 (pH 2.0) 溶液使芯片再生5 min，重复这一过程直到跑完所有待测物的对应浓度。
通过使用Biacore Insight 评估软件 (Cytiva, Marlborough, MA, USA) 将数据全局拟合到 1:1 Langmuir 结合模型，获得结合和解离常数。

四、实验结果及数据分析

按照溶解浓度进行待测物测定，待测物的动力学拟合的测定结果如下所示：

图 蛋白A和小分子B的相互作用测定

五、结论

本次试验的目的是利用 Biacore 测定小分子 B 与蛋白 A 相互作用亲和力，采用 CM5 芯片偶联蛋白的方式进行测定。测定结果如下表所示。

配体	分析物	KD(M)
蛋白 A	小分子B	1.151e-5

KD：解离常数（dissociation constant），反映的是待测物对靶标的亲和力大小，值越小亲和力越强；
Ka：结合速率常数（association rate constant），代表分子间结合时的快慢，值越大表示结合越快；
Kd：解离速率常数（dissociation rate constant），代表分子间解离时的快慢，值越大表示解离越快。

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