RNA Pull down 是研究 RNA-蛋白互作的核心技术之一。它与 LncRNA 的研究密不可分，为 lncRNA 生物学功能的验证起到了至关重要的作用。但在实际操作中，RNA 易降解、亲和力低、背景深等问题让不少研究者头疼。本文整理了钟鼎生物在 RNA pull-down 实验中的 14 个常见问题及解决办法，供大家参考。
- 实验原理：RNA pull-down 如何富集结合蛋白
- LncRNA 的三大研究方向
- RNA 防降解策略
- 亲和力低、背景深、无条带的排查思路
- LncRNA 富集方法：探针法、生物素标记法、TRSA 法
- 对照设置与结果验证
- 常见问题解答（FAQ）
RNA pull down 实验与 LncRNA 的研究是分不开的，为 lncRNA 生物学功能的验证起到了至关重要的作用。它利用了核苷酸片段与转录因子结合的特性原理，对体外转录目的 RNA 进行生物素标记，通过生物素与链酶亲和素的非共价结合。将目的 RNA 固定在磁珠上，当蛋白与核酸发生结合时，形成 RNA-蛋白质复合物，将复合物从磁珠上洗脱下来，通过 western blot 验证及质谱仪检测与核酸结合的蛋白。
核心逻辑：体外转录目的RNA → 生物素标记 → 链霉亲和素磁珠固定 → 与蛋白孵育形成RNA-蛋白复合物 → 洗脱 → Western blot验证已知蛋白 / 质谱鉴定未知蛋白。
视频讲解
RNA pull-down 的很多应用场景与 LncRNA 功能研究密切相关。LncRNA 的研究方向大致可以分为 DNA 水平、RNA 水平和蛋白质水平三个层面。
| DNA水平调控 | RNA水平调控 | 蛋白质水平调控 |
|---|---|---|
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与RNA pull-down的关系：LncRNA 在蛋白质水平调控中的"磷酸化""泛素化""组蛋白调控""蛋白构象改变"等作用，往往需要先确认 LncRNA 与哪些蛋白结合——这正是 RNA pull-down 的核心应用场景。
RNA pull down 实验的一大难点就是 RNA 本身易降解，所以过程中要禁止 RNase，以防止降解。因此在整个实验过程中除了 EP 管、枪头、镊子这些常用的器具需要灭菌，所有试剂均需要 DEPC·H2O 配置并灭菌！
处理后的耗材需要尽快用掉，超过两周则需要重新处理。操作台需要用 RNaseZAP 擦净，以去除环境中的 RNA 酶的影响。
防降解清单：① DEPC·H2O 配置所有试剂并灭菌；② EP管、枪头、镊子等器具灭菌；③ 处理后的耗材尽快用完（超过2周重新处理）；④ 操作台用 RNaseZAP 擦净；⑤ 全程佩戴手套、勤换；⑥ 加入 RNase 抑制剂。
首先确定是不是①缓冲环境有没有优化、②裂解完不完全、③磁珠用量、④RNA 探针用量这几个方面有问题，依次排除，如果都没有问题，就要考虑是不是 RNA 连接生物素的效率低的问题，如果是，那么：
- 可能是 RNA 纯度不够，需要重新纯化；
- RNA 没有变性完全；
- 连接的时间短，建议连接时间不要少于 4 小时，必要时可以 16℃ 过夜。
考虑是不是 SDS-PAGE 染色时间过长或者抗体的质量问题，多克隆抗体经常会出现这种情况，最有可能的情况是样品中包含的非特异性蛋白太多了，针对这一点，有以下解决措施：
- 优化孵育时间、温度、盐浓度等条件；
- 优化缓冲体系，使用严谨性高的缓冲体系；
- 提高裂解液的质量。
不一定。也有可能是体外转录的 RNA 序列有问题；样品中蛋白质浓度过低同样难以观测到条带，当然还会存在实验操作失误的问题。
排查顺序建议：先确认 RNA 探针质量和标记效率 → 再确认蛋白浓度和完整性 → 最后排查操作规范性。必要时可设置已知的阳性 RNA-蛋白对照，验证实验体系是否正常。
富集 LncRNA 问题其实也就是 LncRNA 如何被链霉亲和素识别以及如何带上生物素标记的问题，大致上有三种方法。
- 设计生物素标记的探针
- 可结合内源LncRNA
- 需Northern Blot验证探针特异性
缺点：贵、样品量大
- 5'端加T7启动子
- 体外转录试剂盒制备大量LncRNA
- 生物素标记试剂盒标记
- 95℃→4℃退火（30秒/度）
适用：体外实验
- LncRNA一端加TRSA序列
- 链霉亲和素识别TRSA结构
- 无需生物素标记
适用：特定场景
方法选择建议：探针法适合研究内源 LncRNA，但成本高；生物素标记法适合体外制备大量 LncRNA，成本低；TRSA 法无需生物素标记，适合特殊场景。选择时需根据实验目的、样品量和预算综合权衡。
有，探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列：探针的反义序列以及长非编码 RNA 的反义序列。TRSA 法的对照是 TRSA 序列本身。
验证特异性通常需要从三个层面进行：
- 对照验证：设置反义序列探针、无生物素标记探针、仅磁珠无探针三种对照，确认结合信号来自目标 RNA。
- 剂量依赖验证：通过增加竞争性探针验证结合的竞争性。
- 正交验证：用 RIP 或 EMSA 实验对候选蛋白进行独立验证。
只有多维度验证一致，才能确认 RNA-蛋白互作的特异性。
RNA pull-down 和 RIP 的核心区别在于实验方向和研究问题：
- RNA pull-down：以 RNA 为诱饵，从细胞裂解液中富集结合蛋白，属于体外实验，回答的是"这段 RNA 能结合哪些蛋白"。
- RIP：以抗体为诱饵，从细胞中富集与特定蛋白结合的 RNA，属于体内实验，回答的是"这个蛋白在细胞内结合哪些 RNA"。
RNA pull-down 适合已知 RNA 找蛋白，RIP 适合已知蛋白找 RNA。
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