做 qPCR 实验，第一个要做的决定不是选什么试剂盒，而是——我到底需要相对定量还是绝对定量？这个选择决定了你后续的实验设计、标准品制备方案和数据分析方法。选错了，实验可能白做。本文通过两个典型案例，帮你理清这个问题。
- 先弄清定义：相对定量 vs 绝对定量
- 什么时候用绝对定量：病毒载量检测案例
- 什么时候用相对定量：p53 表达差异案例
- 归一化策略：细胞数目 vs 内参基因
- 2^-△△Ct 法与 Pfaffl 法的选择
- 常见问题解答（FAQ）
在荧光定量PCR实验中，分为相对定量与绝对定量。我们先来复习一下两者的定义。
绝对定量是通过样品的 Ct 值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总 RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。也就是说，当你想找出一个给定样品的本质属性的时候，就应该用绝对定量。
相对定量的分析结果是在相当量的实验组（样品A）和对照组（样品B）中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。
一句话判断：你想知道"这个样品里到底有多少病毒拷贝"——绝对定量。你想知道"癌组织和正常组织中这个基因表达差几倍"——相对定量。前者关注单个样本的本质属性，后者关注多个样本之间的相对关系。
让我们从一个经典的需要绝对定量的样品实例开始。
医生对一个病人的每毫升血液中病毒颗粒数感兴趣。所以医生从 10 毫升血液中提取 DNA，然后通过对病毒 DNA 特异的荧光定量 PCR 检测确定病毒颗粒的数目。通过待测样本的 Ct 值和已知病毒颗粒数的标准曲线进行比较，医生能够确定在分析的 DNA 样品中有 10000 个病毒。基于以上信息，她能够确定每毫升血中有 1000 个病毒。
在以上的例子中，之所以使用绝对定量，是因为医生对给定数量的样品（每毫升血）中的核酸（病毒颗粒数）感兴趣。因此，在这个例子中归一化是"每毫升血"。最终的结果是对单个样品的定量描述，并不依赖于别的样品的性质。换句话说，当你想找出一个给定样品的本质属性的时候，就应该使用绝对定量。
绝对定量的典型应用领域远不止病毒载量检测，还包括：GMO 含量检测（转基因成分的绝对定量）、基因拷贝数测定、病原体载量监测等。这些场景的共同特点是：结果需要以绝对数值呈现，且该数值本身就具有诊断或判定意义。关于绝对定量的更多应用，可参考《绝对定量的应用》。
标准曲线的三个关键指标：①扩增效率 E 应在 90%-110% 之间；②R² 应大于 0.99；③标准曲线浓度范围应覆盖待测样本的实际浓度。没有标准曲线，Ct 值只是一个相对数值，无法换算成绝对量。
举一个经典的应用相对定量实例：
研究者想知道在癌变的和正常的卵巢细胞中 p53 的表达水平是否有差异？如果有差异，相差多少？研究目的是找出等量的 2 种组织中 p53 mRNA 相对的量，或叫"差异倍数"。
根据其希望采用的归一化的类型，研究者可以选择以下任意一种设计。
研究者分别从 1,000 个癌变的和 1,000 个正常卵巢细胞中提取 RNA，对样本进行 p53 mRNA 特异地反转录定量 PCR 实验（RT-qPCR）确定 p53 mRNA 的量，结果显示了从等量癌变的和正常卵巢细胞中提取的 RNA 样本中 p53 mRNA 分子数目的比率，即是 p53 mRNA 的差异倍数。
如果研究者之前已经确定癌变和正常卵巢细胞中 GAPDH mRNA 的表达水平相等，那么，研究者可以从大约等量的癌变和正常卵巢细胞中提取 RNA，而不需要确定细胞的具体数目，然后通过 RT-qPCR 实验来确定样本中 p53 mRNA 和 GAPDH mRNA 的水平。相对于正常细胞，癌细胞中 p53 相对表达量可以由两种不同类型细胞中标准化的 GAPDH 与 p53 的表达水平比例确定。
上述实验中，由于研究者关心等量样本 A 和 B 中靶序列的相对量，因此选择相对定量方法。上述两种分析方法的差异在于所用的标准不同，第一种假设中的标准是细胞数目；第二种假设中的标准是 GAPDH mRNA 表达水平，之前已确认 GAPDH mRNA 表达水平在两种不同类型细胞中是保持不变的恒量。两个实例的最后结果都是对一个样本某一特性相对其它样本同一特性的数量描述，即用相对定量去比较多个样本间某一特定性质。
关于相对定量的更多应用领域，可参考《相对定量的应用》。
选择归一化标准的核心原则：细胞数目归一化适用于能从等量细胞出发的实验；内参基因归一化适用于无法精确计数细胞、或实验处理会影响细胞数量的情况。无论选哪种，关键是要保证归一化标准在实验组和对照组之间保持一致。
相对定量的结果是否可靠，归一化策略的选择至关重要。两种主流策略各有适用条件和注意事项。
| 对比维度 | 细胞数目归一化 | 内参基因归一化 |
|---|---|---|
| 核心思路 | 保证实验组和对照组起始细胞数量一致 | 用稳定表达的内参基因校正上样量差异 |
| 前提条件 | 能精确计数细胞，且提取效率一致 | 内参基因在实验条件下表达稳定 |
| 常用内参 | 不涉及 | GAPDH、ACTB、18S rRNA、UBQ、TUBB |
| 优势 | 直观，不依赖内参基因的稳定性假设 | 可校正RNA提取和逆转录的效率差异 |
| 局限 | 难以精确控制，细胞体积差异影响大 | 没有哪个内参基因是"万能"的，需预实验验证 |
| 适用场景 | 培养细胞实验，细胞状态一致 | 组织样本、临床样本、处理条件复杂的实验 |
内参基因的选择不能凭经验"照搬"。不同组织、不同处理条件下，内参基因的稳定性可能完全不同。建议在正式实验前，用 geNorm、NormFinder 或 BestKeeper 等工具评估 3-5 个候选内参基因的稳定性，选择最稳定的 1-2 个作为内参。如果找不到单一稳定内参，可以考虑使用多个内参基因的几何平均值。
相对定量的数据分析方法主要有两种，选择哪一种取决于你的扩增效率是否理想。
这是最常用的相对定量方法，核心公式为：表达量 = 2-△△Ct，其中 △△Ct = △Ct（实验组）- △Ct（对照组），△Ct = Ct（靶基因）- Ct（内参基因）。
前提条件：靶基因和内参基因的扩增效率相近且接近 100%（通常在 90%-110% 之间）。当扩增效率偏离这个范围时，该方法会产生较大误差。
当靶基因和内参基因的扩增效率不一致时，应改用 Pfaffl 法。Pfaffl 法的核心思路是用各自的扩增效率对 Ct 值差异进行校正，公式为：Ratio = (E靶)△Ct靶(对照-实验) / (E内参)△Ct内参(对照-实验)。
Pfaffl 法要求必须通过标准曲线测定靶基因和内参基因各自的扩增效率，比 2^-△△Ct 法更精确，但操作也更复杂。
| 对比维度 | 2^-△△Ct 法 | Pfaffl 法 |
|---|---|---|
| 核心前提 | 靶基因与内参基因扩增效率相近（90%-110%） | 靶基因与内参基因扩增效率可不同 |
| 是否需要标准曲线 | 不强制，但建议验证效率 | 必须，需测定各自扩增效率 |
| 计算复杂度 | 低 | 中 |
| 适用场景 | 常规基因表达分析 | 扩增效率不理想或差异较大时 |
选择建议：如果预实验已确认靶基因和内参基因的扩增效率都在 90%-110% 范围内，2^-△△Ct 法即可满足需求。如果效率偏离较大，或无法确认效率一致性，用 Pfaffl 法更稳妥。
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- 荧光定量PCR绝对定量的应用领域：病毒、病原体的检测，以及药学领域中对一些核酸治疗剂药物的药代动力学评价方面。
- 荧光定量PCR相对定量的应用领域：基因的表达研究、microRNA 定量分析。
- 荧光定量PCR技术服务：高通量荧光定量PCR检测服务。
- 微滴式数字PCR：ddPCR 的原理与应用场景。
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