闭环 DNA（closed circular DNA）没有断口的双链环状 DNA，亦称为超螺旋 DNA。超螺旋比例 90% 以上是比较理想的真核表达质粒，较低的超螺旋比例会降低表达量近 50% 以上。

CHO 细胞即中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，自身很少分泌内源蛋白，因此有利于目的蛋白的纯化分离。相较于其他细胞类型，CHO 细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞，原因如下：

1. 能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长；
2. 该细胞基因组信息明确，在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性；
3. 能够表达与人相似的翻译后修饰。

此外，CHO 细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易地得到基因改造的细胞。然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，导致 CHO 细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。

HEK293 细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一，它具有以下优势：更快的生长速度、更高的生长密度、转染效率高，表达后修饰更接近人体蛋白的结构，可能会有潜在的人病毒污染。

我们常用的系统是 2936E 细胞配套 PTT5(pAZ5) 载体。HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了 EBV 病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1)，该蛋白可以保证含有 EBV 病毒复制原点（EBV ori）的质粒在 HEK293E 细胞株中复制，提高质粒的拷贝数，进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。该系统比常规的 293F 细胞表达量要高。

PTT5(pAZ5) 载体图谱

常见原因可以归为以下几类：

难表达蛋白：细胞因子、激素、抗菌肽、衣壳蛋白、膜蛋白。

信号肽位于分泌蛋白的 N 端，一般由 15～30 个氨基酸组成，包括三个区：

• 一个带正电信号肽的 N 末端，称为碱性氨基末端；
• 一个中间疏水序列，以中性氨基酸为主，能够形成一段 α 螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；
• 一个较长的带负电荷的 C 末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点，也称加工区。

当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒（SRP）所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔，而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。

信号肽只是一个搬运工具，它能够促进蛋白搬运到胞外区。有的蛋白胞内的组织蛋白或者结构蛋白等分泌能力较弱的蛋白，可能就不能被信号肽酶切除。

10 kd–120 kd。分子量大于 150 KD、小于 5 KD 表达是有难度的，但是昆虫系统对大分子蛋白表达是有优势的，目前我们接触过 250 KD 的蛋白用昆虫杆状病毒表达系统表达成功。

生物药蛋白、分泌蛋白、糖基化修饰高的蛋白、需要活性蛋白、内毒素要求控制的蛋白、亚细胞定位在胞外的蛋白。

以上说明不代表昆虫不能做。

哺乳动物细胞蛋白表达系统表达的蛋白基本上有活性，但是蛋白不一样，很多蛋白没有活性可能是蛋白本身原因，比如亲水性差、可溶性差、不稳定等。