GST pull-down是体外检测蛋白间直接互作的行之有效的方法，可用于证实预测的蛋白质-蛋白质相互作用的存在，也可用作未知的蛋白质-蛋白质相互作用的初始筛选测定法。
本文以钟鼎生物的典型实验案例为线索，系统讲解GST pull-down的技术原理、实验设计、融合蛋白诱导表达、GST/Ni柱纯化及pull-down实验的完整操作流程，并附实验体系表、速查表与常见问题解答，供实验参考。
本文内容速览：
- 一、GST pull-down 的原理
- 二、实验设计——四组对照体系
- 三、IPTG诱导融合蛋白表达
- 四、细胞破碎及蛋白纯化（GST柱 / Ni柱）
- 五、GST pull-down实验操作
- 六、实验流程速查表
- 七、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、GST pull-down 的原理
GST pull-down 实验基于 GST（glutathione-S-transferase，谷胱甘肽-S-转移酶），它可以与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）特异性结合。
将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠；将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠结合。若环境中存在与X蛋白互作的蛋白Y，则会形成"琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y"复合物，与X蛋白互作的蛋白即可被分离并检测。
GST标签与GSH特异结合，诱饵蛋白X与互作蛋白Y结合，形成"琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y"复合物。离心收集琼脂糖珠，即可将与X互作的蛋白Y一同分离下来，用于SDS-PAGE或Western Blot检测。
PART 02二、实验设计——四组对照体系
本实验基于钟鼎生物实际案例，验证预测的两个蛋白（A与B）之间的互作。为了区分特异性互作与非特异吸附，共设置4组对照体系：
| 组份 | 1 | 2 | 3 | 4 |
|---|---|---|---|---|
| A-GST | + | − | − | + |
| B-His | − | + | + | + |
| GST | − | − | + | − |
四组对照的作用：
- 第1组：A-GST + B-His → 验证A与B是否互作。
- 第2组：B-His单独 → 检测B-His是否被GSH树脂非特异吸附。
- 第3组：GST + B-His → 检测GST标签本身是否与B-His非特异结合。
- 第4组：A-GST + B-His（重复）→ 作为第1组的重复验证，提高结果可靠性。
PART 03三、IPTG诱导融合蛋白表达
将诱饵蛋白A与GST标签融合（pGEX-4T-1-A），将靶蛋白B与His标签融合（pET28a-B-His），分别通过IPTG诱导表达。
1.1 表达载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态。
1.2 挑取转化平板上的单克隆接种于含 50 μg/mL Amp 的3 mL LB培养液的试管中，37℃摇菌过夜，制备种子液。
1.3 次日按 1:100 接种于含50 μg/mL Amp的30 mL LB培养液中，37℃摇至菌体 OD₆₀₀ = 0.8。
1.4 向菌液中加入IPTG至终浓度为 0.5 mM，11–28℃ 摇床培养，诱导融合蛋白表达 4–8 h。
1.5 将菌液离心弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，超声波破碎，离心取上清。
1.6 吸取少量上清用于SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。
关键参数汇总：菌体 OD₆₀₀ = 0.8 → IPTG终浓度 0.5 mM → 诱导温度 11–28℃ → 诱导时间 4–8 h。低温诱导是保证融合蛋白可溶性的关键。
PART 04四、细胞破碎及蛋白纯化
采用超声破碎，分别使用GST柱亲和纯化和Ni柱亲和纯化，获得纯化后的目的蛋白。
（1）利用低压层析系统，细胞裂解上清液上样至GST Binding-Buffer预平衡的GST亲和层析柱。
（2）用GST Binding-Buffer冲洗层析柱，至流出液 OD₂₈₀值到达基线。
（3）用GST Elution-Buffer洗脱目的蛋白，收集流出液。
（4）收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用Tris-HCl透析过夜。
（5）进行SDS-PAGE分析和WB分析。
（1）利用低压层析系统，细胞裂解上清液上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱。
（2）用Ni-IDA Binding-Buffer冲洗层析柱，至流出液 OD₂₈₀值到达基线。
（3）用Ni-IDA Washing-Buffer冲洗层析柱，至流出液OD₂₈₀值到达基线。
（4）用Ni-IDA Elution-Buffer洗脱目的蛋白，收集流出液。
（5）收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用Tris-HCl进行透析过夜。
（6）进行SDS-PAGE分析和WB分析。
两种纯化方式对比：GST柱利用GST-GSH特异性结合纯化A-GST融合蛋白，洗脱时使用含还原型谷胱甘肽的洗脱液；Ni柱利用His标签与Ni²⁺螯合纯化B-His融合蛋白，洗脱时使用含咪唑的洗脱液。两种标签互不干扰，可分别纯化后再进行pull-down互作检测。
PART 05五、GST pull-down 实验操作
使用 GST Protein Interaction Pull-Down Kit（购自Thermo公司）进行蛋白互作检测，操作分为三步：
（1）混匀Immobilized Glutathione，彻底重悬树脂。
（2）各取 100 µL 50%树脂悬浮液到4个离心管中，1250 ×g 离心2 min弃上清。
（3）用 500 µL PBS 重悬树脂，1250 ×g 离心2 min移除上清，重复3次。
（1）按照表1分别将A-GST蛋白和B-His蛋白加入到谷胱甘肽树脂中，将混合物在 4℃旋转混匀孵育过夜。
（2）1250 ×g 离心5 min 后，弃上清（上清要取净）。
（3）用 500 µL PBS 重悬树脂，1250 ×g 离心2 min弃上清，重复3次。
（1）每管加入 50 µL Elution Buffer。
（2）4℃旋转混匀孵育20 min。
（3）1250 ×g 离心2 min弃上清，离心下来的液体置于冰上。
（4）取 20 µL 样品进行SDS-PAGE和WB检测。
速查六、实验流程速查表
| 阶段 | 关键操作 | 关键参数 |
|---|---|---|
| 转化与接种 | 载体转化Rosetta；单克隆接种含Amp的LB | 50 μg/mL Amp；37℃摇菌过夜 |
| 诱导表达 | 1:100接种；OD₆₀₀=0.8时加入IPTG | IPTG终浓度 0.5 mM；11–28℃；4–8 h |
| 细胞破碎 | 离心弃上清；PBS重悬；超声破碎 | 离心取上清用于后续纯化 |
| GST柱纯化 | 上样 → 冲洗 → 洗脱 → 透析 | 冲洗至 OD₂₈₀ 到达基线；Tris-HCl 透析过夜 |
| Ni柱纯化 | 上样 → 冲洗 → Washing → 洗脱 → 透析 | 冲洗至 OD₂₈₀ 到达基线；Tris-HCl 透析过夜 |
| 平衡树脂 | 100 µL 50%树脂悬浮液；PBS洗涤3次 | 1250 ×g 离心2 min |
| 蛋白互作 | 按表1加样；4℃旋转混匀孵育 | 孵育过夜；PBS洗涤3次 |
| 洗脱 | 加Elution Buffer；4℃旋转孵育20 min | 50 µL Elution Buffer；取20 µL 检测 |
| 检测 | SDS-PAGE 和 Western Blot | 对照四组同时检测 |
FAQ七、常见问题解答
Q1：GST pull-down的原理是什么？
GST Pull-Down实验基于GST（glutathione-S-transferase，谷胱甘肽-S-转移酶）可以与谷胱甘肽（GSH）结合。将GSH固定于琼脂糖珠上形成GSH-琼脂糖珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠结合，若环境中存在与X蛋白互作的蛋白Y，则会形成"琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y"复合物，与X蛋白互作的蛋白即可被分离并检测。
Q2：GST pull-down实验为什么要设置对照组？
实验设计通常设置4组：1组（A-GST + B-His）、2组（B-His单独）、3组（GST单独 + B-His）、4组（A-GST + B-His重复）。通过多组对照，可区分诱饵蛋白A与目标蛋白B的特异性互作、GST标签本身的非特异吸附，以及His标签的非特异结合，确保结果可信。
Q3：GST融合蛋白诱导表达的关键条件是什么？
关键条件：1）表达载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态；2）菌体OD₆₀₀达到0.8时加入IPTG；3）IPTG终浓度为0.5 mM；4）11–28℃低温诱导4–8 h；5）PBS重悬后超声破碎，离心取上清；6）SDS-PAGE检测表达情况。
Q4：GST柱纯化和Ni柱纯化有什么区别？
GST柱亲和纯化利用GST与谷胱甘肽（GSH）的特异性结合，用于纯化GST融合蛋白，洗脱用GST Elution-Buffer（含还原型谷胱甘肽）；Ni柱纯化利用His标签与Ni-IDA的螯合作用，用于纯化His融合蛋白，洗脱用Ni-IDA Elution-Buffer（含咪唑）。两者分别对应诱饵蛋白和靶蛋白的纯化需求。
Q5：GST pull-down实验中为什么要孵育过夜？
GST pull-down实验中，蛋白互作采用4℃旋转混匀孵育过夜的方式。低温（4℃）可降低蛋白酶活性、减少蛋白降解，同时促进特异性互作形成；缓慢旋转混匀保证树脂与样品充分接触；过夜孵育则保证结合达到平衡，提高弱互作的检测灵敏度。
猜您想看：
- 服务案例：通过图片结果直观地认知GST pull-down的整个流程
- GST pull-down原理：简单介绍GST pull-down的技术原理
- GST pull-down注意事项：高纯度的融合蛋白、GST标签、DNA和RNA
相关服务
联系我们
 |
南京栖霞区红枫科技园 A6 栋 2 层 |
 |
E-mail：order@zoonbio.com |
 |
技术热线电话：400-066-8086 |
 |
025-85634800 025-85454800 025-85774800 025-84448440 |