凝胶阻滞实验（EMSA）流程

Q: EMSA实验中蛋白用量多少合适？

使用核蛋白时，用量为3–5 μg；使用纯化蛋白时，用量为200–500 ng。可以根据预实验结果适当调整，以形成清晰的特异复合物条带为准。

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凝胶阻滞实验（EMSA）是一种体外分析DNA与特异性蛋白质之间相互作用的技术。蛋白质与末端标记的核酸探针结合后，电泳时复合物比游离探针泳动速度慢，出现相对滞后的条带——这就是EMSA检测的核心逻辑。

本文把整个实验流程拆开讲清楚：从实验原理、试剂配制、分离胶制备、探针标记，到蛋白与探针孵育、点样电泳、显影，每一步都附关键参数与操作要点，可直接对照实验台使用。

本文内容速览：

一、实验原理——复合物滞后条带的形成
二、实验目的——体外分析DNA与蛋白互作
三、试剂与仪器清单
四、操作步骤（制胶 → 标记探针 → 孵育 → 电泳 → 显影）
五、关键参数速查表
六、注意事项
七、常见问题解答（FAQ）

PART 01一、实验原理

EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay），即电泳迁移率变动分析。蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，出现相对滞后的条带。

凝胶阻滞实验原理图

凝胶阻滞实验基本原理图

核心逻辑：游离探针 → 电泳速度快 → 位于凝胶下方；蛋白-探针复合物 → 分子量增大、电荷改变 → 电泳速度慢 → 位于凝胶上方（滞后条带）。通过滞后条带的有无和强弱，判断蛋白与DNA是否结合及结合强度。

PART 02二、实验目的

体外分析DNA与特异性蛋白质之间的相互作用。

💡 应用场景

EMSA常用于转录因子与启动子结合验证、DNA结合蛋白的筛选与鉴定、突变对结合能力的影响分析，以及药物或化合物对DNA-蛋白互作的干扰研究。

PART 03三、试剂与仪器清单

试剂：

大片段DNA聚合酶（Large Fragment DNA Polymerase I）：invitrogen，USA，Cat no. 18012-021
dNTP*（专用）：由dATP、dTTP、dGTP（Takara，Japan，D4026A、D4027A、D4029A）按 1:1:1 配制；即各取1 µl，再加入497 µl灭菌双蒸水混匀
10× M buffer：TaKaRa，CA1401B（Takara酶切试剂中附带的紫盖buffer）
10× binding Buffer：80% 甘油 62.5 µl、0.1 M MgCl₂ 10 µl、5 M NaCl 10 µl、1 M Tris-HCl（pH=8.0）10 µl、0.5 M EDTA 2 µl、1 M DTT 1 µl、ddH₂O 4.5 µl，至总体积100 µl
电泳缓冲液：甘氨酸（Glycine）18.8 g，Tris粉3.02 g，加单蒸水定容至1 L
10× Loading Buffer：TaKaRa，CA2601A（Takara酶切试剂中附带）

仪器：

蛋白质分离胶电泳仪（同位素室配置）

PART 04四、操作步骤

步骤 1　制分离胶（6% SDS-PAGE，8 ml 用量）

6% SDS-PAGE 分离胶配方（8 ml）
组分	用量
ddH₂O	4.24 ml
30% Acrylamide	1.60 ml
1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）	2.00 ml
10% SDS	0.08 ml
10% AP	0.08 ml
TEMED	0.0064 ml

步骤 2　标记探针

探针标记反应体系（20 µl 总体积）
组分	用量
探针	4 µl
dNTP*（专用）	2 µl
10× M buffer	2 µl
大片段DNA聚合酶	1 µl
ddH₂O	9 µl
α³²P-dCTP	2 µl

反应条件：室温 40 min – 1 hour。在第3步使用时需补充 30 µl ddH₂O 稀释。

步骤 3　蛋白与探针混合孵育

1）蛋白、核蛋白 3–5 µg；如是纯化蛋白，200–500 ng。

2）10× binding Buffer 2 µl。

3）补 ddH₂O 至 16 µl。

4）轻弹混匀后低速离心 1 min。

5）在同位素室将稀释后的探针 4 µl 加到第4步的离心管管底（同位素室加），轻弹混匀。

6）室温中放置，将探针与DNA混合孵育 15–20 min。

步骤 4　点样

1）用20 µl小枪分装 10× loading buffer 2–3 µl 到每管管内壁上，作为指示剂。

2）用20 µl小枪同时吸取内壁指示剂和管底样品进行点样，80–90 V 电压电泳约 1.5–2.0 h。

3）压X光片 4–5 h。用比制胶板略大的两块滤纸将胶卸下，在挡板后用保鲜膜包好，然后压在暗夹内（根据所用同位素信号强弱，新订购回来的同位素时间可以缩短为 2–3 h）。

步骤 5　显影

准备三个盆子，左边是显影液，中间是自来水，右边是定影液。在显影液漂洗几秒钟，在中间的水中清洗几秒钟，放在红灯上观察，再定影（时间可以稍长）。

速查五、关键参数速查表

EMSA实验全流程关键参数
阶段	关键操作	关键参数
制分离胶	6% SDS-PAGE 配制	8 ml 体系；TEMED 0.0064 ml 最后加
标记探针	大片段DNA聚合酶 + α³²P-dCTP	20 µl 体系；室温 40 min–1 h
蛋白用量	核蛋白 / 纯化蛋白	核蛋白 3–5 µg；纯化蛋白 200–500 ng
孵育	探针与蛋白混合	室温 15–20 min
点样与电泳	指示剂 + 样品同时点入	80–90 V，1.5–2.0 h
压片	X光片曝光	4–5 h（新同位素可缩短至2–3 h）
显影	显影液 → 水洗 → 定影	显影数秒，定影可稍长

注意六、注意事项

⚠ 关键操作提醒

指示剂与游离探针的位置相近，最终X光片上需要保留游离探针信号，不能让指示剂跑出去。
卸下的两块小玻璃板必须在同位素室有机玻璃挡板后的水龙头上反复冲洗以消除信号，方可带回实验室。
涉及同位素的操作必须严格遵循同位素实验室安全规范，佩戴防护装备。
α³²P 为放射性同位素，操作需在指定区域进行，废弃物料按放射性废物处理。

FAQ七、常见问题解答

Q1：凝胶阻滞实验（EMSA）的原理是什么？

蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，出现相对滞后的条带。这就是凝胶阻滞实验（EMSA）的基本原理。

Q2：EMSA实验中蛋白用量多少合适？

使用核蛋白时，用量为3–5 µg；使用纯化蛋白时，用量为200–500 ng。可以根据预实验结果适当调整，以形成清晰的特异复合物条带为准。

Q3：EMSA实验探针与蛋白孵育多长时间？

标记探针室温孵育40 min–1 h；探针与蛋白混合后，在室温中放置孵育15–20 min。孵育时间和温度可根据结合动力学特点适当调整。

Q4：EMSA电泳条件如何设置？

使用6% SDS-PAGE分离胶（8 ml用量），点样后在80–90 V电压下电泳约1.5–2.0 h。指示剂与游离探针位置相近，最终X光片上需保留游离探针信号，不能让指示剂跑出去。

Q5：EMSA实验卸下的玻璃板如何处理？

卸下的两块小玻璃板必须在同位素室有机玻璃挡板后的水龙头上反复冲洗，以消除信号，方可带回实验室。这是同位素实验的安全要求，务必严格执行。

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