EMSA实验能否跑出清晰、可判读的条带，很大程度上取决于琼脂糖凝胶电泳的分离效果。而影响电泳迁移速率的因素不止一个——DNA本身的大小和构型、凝胶浓度、电压、染料、缓冲液离子强度，每一项都会改变最终条带的位置和分辨率。
本文系统梳理6大影响因素，并附关键参数速查表与常见问题解答，帮助你在实验前把条件选对，减少反复试错。
本文内容速览：
- 一、DNA的分子大小及构型
- 二、琼脂糖浓度
- 三、DNA分子的构象
- 四、电源电压
- 五、嵌入染料的存在
- 六、离子强度影响
- 七、关键参数速查表
- 八、常见问题解答（FAQ）
PART 01一、DNA的分子大小及构型
不同构型DNA的移动速度次序为：
共价闭环DNA（cccDNA） > 直线DNA > 开环的双链环状DNA
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0）。由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度。
PART 02二、琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
| DNA片段大小 | 推荐琼脂糖浓度 |
|---|---|
| 小于 0.5 kb | 1.2 – 1.5% |
| 0.5 – 10 kb（介于两者之间） | 0.8 – 1.0% |
| 大于 10 kb | 0.3 – 0.7% |
PART 03三、DNA分子的构象
当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的：超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。
在电泳鉴定质粒纯度时，若发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起，还是因为含有其他DNA引起，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳。如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
PART 04四、电源电压
琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。
但是，在电场强度增加时，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大。因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
关键参数：要使大于 2 kb 的DNA片段的分辨率达到最大，电场强度不宜高于 5 V/cm。
PART 05五、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙锭（EB）用于检测琼脂糖凝胶中的DNA。染料会嵌入到堆积的碱基对之间，并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低约15%。
实验提示：由于EB对DNA迁移率有影响，在需要精确比较DNA片段大小时，应保持所有样品染色条件一致；如果使用GelRed等替代染料，也需注意不同染料对迁移率的影响可能存在差异。
PART 06六、离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率：
- 无离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶）：电导率最小，DNA几乎不移动。
- 高离子强度缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液）：电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有：
| 缓冲液 | 组成 |
|---|---|
| TAE | 含 EDTA（pH 8.0）和 Tris-乙酸 |
| TBE | Tris-硼酸和 EDTA |
| TPE | Tris-磷酸和 EDTA |
一般配制成浓缩母液，储于室温。
速查七、关键参数速查表
| 影响因素 | 关键参数 / 规律 | 实验提示 |
|---|---|---|
| DNA构型迁移顺序 | cccDNA > 直线DNA > 开环双链环状DNA | 主要取决于凝胶浓度 |
| DNA大小与迁移率 | 迁移速率与分子量对数成反比 | 分子越大迁移越慢 |
| 琼脂糖浓度（<0.5 kb） | 1.2 – 1.5% | 小片段需高浓度胶 |
| 琼脂糖浓度（0.5–10 kb） | 0.8 – 1.0% | 常规片段通用浓度 |
| 琼脂糖浓度（>10 kb） | 0.3 – 0.7% | 大片段需低浓度胶 |
| 电源电压 | 低电压分离效果好；>2 kb 片段电场强度 ≤ 5 V/cm | 高电压会缩小有效分离范围 |
| 嵌入染料（EB） | 使线状DNA迁移率降低约15% | 所有样品染色条件需一致 |
| 离子强度 | 无离子DNA几乎不移动；高离子明显产热 | 使用1×工作浓度缓冲液 |
FAQ八、常见问题解答
Q1：不同构型DNA的电泳迁移速度顺序是怎样的？
不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA（cccDNA）> 直线DNA > 开环的双链环状DNA。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，迁移越慢。
Q2：不同大小DNA片段应该选择什么琼脂糖浓度？
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系，凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5 kb的DNA片段所需胶浓度为1.2–1.5%；分离大于10 kb的DNA分子所需胶浓度为0.3–0.7%；DNA片段大小介于两者之间则所需胶浓度为0.8–1.0%。
Q3：为什么超螺旋DNA比线状DNA跑得快？
当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动的距离不仅和分子量有关，还和它本身的构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度不一样：超螺旋DNA移动最快，线状双链DNA移动最慢。
Q4：EMSA电泳时电压应该如何选择？
琼脂糖凝胶分离大分子DNA时，在低浓度、低电压下分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但电场强度增加时，不同分子量的DNA片段的迁移率会以不同幅度增长，片段越大因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2 kb的DNA片段的分辨率达到最大，电场强度不宜高于5 V/cm。
Q5：溴化乙锭（EB）对DNA电泳迁移率有什么影响？
荧光染料溴化乙锭（EB）用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低约15%。
Q6：电泳缓冲液离子强度对DNA电泳有什么影响？
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。对于天然的双链DNA，常用电泳缓冲液有TAE、TBE、TPE，一般配制成浓缩母液，储于室温。
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