DNA Pull down 的对照通常有两种方案：

• 方案一：选择一个非生物素标记的 DNA 序列作为对照组，主要是去除跟链亲和素树脂结合的一些蛋白。
• 方案二：使用一个无义的序列，需要用生信的方法跟基因组数据比对。

也有对照用 LacZ 基因，这个比较多人用。有时也会用 GFP 的序列，其实就是找一段无关序列。如果为了有一些明确的基因序列需要剔除，可以用一些其他的基因序列作为对照组来做这个实验。

做 DNA Pull down 的蛋白一般有两种，分别是核蛋白与总蛋白，这个有什么区别呢？

• 核蛋白：因为 DNA 结合的区域大多数转录因子，尽量选取核蛋白来进行，减少杂蛋白的干扰。
• 总蛋白：有一些材料的细胞核或核蛋白非常困难，或者研究的不是跟转录因子的结合，而是跟组织蛋白或者结构蛋白结合的，这种情况下就选用总蛋白。

起始材料量取决于蛋白丰度和检测手段：

• 高丰度转录因子：1-5 mg 总蛋白或 100-500 μg 核蛋白通常足够。
• 低丰度转录因子：建议使用 10-50 mg 总蛋白或 1-5 mg 核蛋白。
• 质谱鉴定：建议起始材料不少于 5 mg 总蛋白，以保证足够的肽段覆盖度。

减少非特异性结合的关键措施包括：

• 使用经过充分预清除的裂解液；
• 在结合和洗涤缓冲液中加入适量的非特异性竞争 DNA（如鲑鱼精 DNA）；
• 加入非离子型去垢剂（如 0.1%-0.5% NP-40 或 Triton X-100）；
• 适当提高洗涤缓冲液的盐浓度（如 150-300 mM NaCl）；
• 设置严格的阴性对照；
• 探针设计时避免重复序列和高 GC 含量。

常用的洗脱方式有三种：

• 生物素竞争洗脱：加入过量游离生物素，温和洗脱，保持蛋白复合物完整性，适合后续功能实验。
• SDS 上样缓冲液直接洗脱：加入 2×SDS loading buffer 煮沸，适合 Western blot 检测。
• 高盐或低 pH 洗脱：适用于特定离子交换或亲和洗脱条件。

选择哪种方式取决于下游用途：Western blot 推荐 SDS 洗脱，质谱推荐生物素竞争洗脱。

蛋白拉下来后有两种用途：

• 第一种用途：直接用这个复合物去做 Western blot，这种情况下，主要是验证是否含有某一种明确的蛋白。
• 第二种方案：直接把拉下来的蛋白送去做 LC-MS，明确沉淀物中包含哪些蛋白。当然通过第二种方法会得到的数据量比较大。

验证特异性通常需要从三个层面进行：

• 对照验证：设置无生物素标记探针、无关序列探针、无探针磁珠三种对照，确认结合信号来自目标探针。
• 剂量依赖验证：通过增加竞争性探针验证结合的竞争性。
• 正交验证：用 EMSA 或 ChIP 实验对候选蛋白进行独立验证。

只有多维度验证一致，才能确认 DNA-蛋白互作的特异性。

DNA pull-down 与 ChIP 的核心区别在于实验方向和研究问题：

• DNA pull-down：以 DNA 序列为诱饵，从细胞裂解液中富集结合蛋白，属于体外实验，回答的是"这段 DNA 能结合哪些蛋白"。
• ChIP：以抗体为诱饵，从细胞中富集与特定蛋白结合的 DNA 片段，属于体内实验，回答的是"这个蛋白在细胞内结合哪些 DNA 区域"。

DNA pull-down 适合筛选未知结合蛋白，ChIP 适合验证已知蛋白在体内的结合位点。

常见失败原因包括：

• 探针问题：生物素标记效率低、探针降解、探针设计不合理；
• 磁珠问题：链霉亲和素磁珠结合能力下降、磁珠未充分封闭；
• 裂解液问题：蛋白降解、缓冲液成分不合适；
• 结合条件问题：盐浓度过高或过低、洗涤过于严格；
• 对照设计问题：阴性对照不严格导致假阳性结果；
• 检测手段问题：Western blot 抗体不识别或质谱灵敏度不足。

DNA pull down的原理是先将含脱硫生物素的DNA pull down探针结合到链霉亲和素Beads上，再将DNA-Beads和细胞裂解液孵育，这样DNA结合蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将DNA结合蛋白从Beads洗脱下来，得到DNA pull down产物。DNA-protein复合物既可以做western-blot检测特定蛋白是否与靶DNA片段结合，又可以做质谱鉴定筛选出与DNA片段可能互作的蛋白信息。

DNA pull down在很多情况下可以替代酵母单杂实验。相对酵母单杂交优势：不需要构建文库，不需要筛选启动子的核心区域，不需要顾及启动子是否有自激活；可以直接提取分离核蛋白，避免跟细胞质及亚细胞器中很多结构蛋白的结合，数据更聚焦；用液相质谱检测，灵敏度比较高，纳克级别的转录因子都可以被检测到。相对劣势：DNA pull down属于体外结合，DNA探针没办法像体内那样实现甲基化修饰，与实际结合状态会有较大差异；选择的是某一个时间点的一个材料，可能转录因子丰度极低或处于沉默状态；很多转录因子同源性较高，仅凭几个肽段很难精确锁定亚型。

DNA pull-down以感兴趣的DNA序列为中心，寻找与该序列结合的蛋白质，最常见的应用是寻找某特定基因启动子区域的转录因子。启动子通常位于结构基因5'端上游，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。转录因子也称为反式作用因子，是一种DNA结合蛋白，能够与真核基因的顺式作用元件特异性结合来激活或抑制基因表达。寻找启动子序列的特异转录因子，有助于理解这些启动子下游的功能基因是如何被调控的。

DNA pull down的探针长度一般情况下控制在300-4000bp，理想区间为1000-2000bp。探针太短结合的蛋白太少，太长则存在大量的非特异性结合。尽量避免DNA序列有非常多的重复结构或高GC含量。

DNA Pull down的对照通常有两种方案：一种是选择一个非生物素标记的DNA序列作为对照组，主要是去除跟链亲和素树脂结合的一些蛋白；第二种方案是使用一个无义的序列，需要用生信的方法跟基因组数据比对。也有对照用LacZ基因，这个比较多人用，有时也会用GFP的序列，其实就是找一段无关序列。如果有明确的基因序列需要剔除，可以用一些其他的基因序列作为对照组。

做DNA Pull down的蛋白一般有两种：核蛋白与总蛋白。因为DNA结合的区域大多数转录因子，尽量选取核蛋白来进行，减少杂蛋白的干扰。但有一些材料细胞核或核蛋白非常困难，或者研究的不是跟转录因子的结合，而是跟组织蛋白或者结构蛋白结合，这种情况下就选用总蛋白。

大多数人潜意识里会认为DNA pull down可能更简单一点，但实际上RNA成功率更高，结合的蛋白会更多。这取决于探针：做DNA Pull down时，DNA探针是用双链的，双链的DNA探针会形成一个双螺旋的结构，相对来讲比较稳。而RNA是单链的，它会自我形成很多二级结构，在二级结构基础之上会形成三级结构、四级结构，形成一个非常复杂的空间结构，蛋白质的结合概率将会大大增加，因此RNA pull down成功率更高。但RNA本身不是特别稳定，操作失误的话会出现降解的情况。

蛋白拉下来后有两种用途：第一种用途是直接用这个复合物去做Western blot，主要验证是否含有某一种明确的蛋白；第二种方案是直接把拉下来的蛋白送去做LC-MS，明确沉淀物中包含哪些蛋白。通过第二种方法会得到的数据量比较大。

起始材料量取决于蛋白丰度和检测手段。如果目标蛋白是高丰度转录因子，1-5 mg总蛋白或100-500 μg核蛋白通常足够；如果目标蛋白是低丰度转录因子，建议使用10-50 mg总蛋白或1-5 mg核蛋白。对于质谱鉴定，建议起始材料不少于5 mg总蛋白，以保证足够的肽段覆盖度。

减少非特异性结合的关键措施包括：①使用经过充分预清除的裂解液；②在结合和洗涤缓冲液中加入适量的非特异性竞争DNA（如鲑鱼精DNA）；③加入非离子型去垢剂（如0.1%-0.5% NP-40或Triton X-100）；④适当提高洗涤缓冲液的盐浓度（如150-300 mM NaCl）；⑤设置严格的阴性对照；⑥探针设计时避免重复序列和高GC含量。

常用的洗脱方式有三种：①生物素竞争洗脱——加入过量游离生物素，温和洗脱，保持蛋白复合物完整性，适合后续功能实验；②SDS上样缓冲液直接洗脱——加入2×SDS loading buffer煮沸，适合Western blot检测；③高盐或低pH洗脱——适用于特定离子交换或亲和洗脱条件。选择哪种方式取决于下游用途：Western blot推荐SDS洗脱，质谱推荐生物素竞争洗脱。

验证特异性通常需要从三个层面进行：①对照验证——设置无生物素标记探针、无关序列探针、无探针磁珠三种对照，确认结合信号来自目标探针；②剂量依赖验证——通过增加竞争性探针验证结合的竞争性；③正交验证——用EMSA或ChIP实验对候选蛋白进行独立验证。只有多维度验证一致，才能确认DNA-蛋白互作的特异性。

DNA pull-down与ChIP的核心区别在于实验方向和研究问题。DNA pull-down以DNA序列为诱饵，从细胞裂解液中富集结合蛋白，属于体外实验，回答的是"这段DNA能结合哪些蛋白"；ChIP以抗体为诱饵，从细胞中富集与特定蛋白结合的DNA片段，属于体内实验，回答的是"这个蛋白在细胞内结合哪些DNA区域"。DNA pull-down适合筛选未知结合蛋白，ChIP适合验证已知蛋白在体内的结合位点。

常见失败原因包括：①探针问题——生物素标记效率低、探针降解、探针设计不合理；②磁珠问题——链霉亲和素磁珠结合能力下降、磁珠未充分封闭；③裂解液问题——蛋白降解、缓冲液成分不合适；④结合条件问题——盐浓度过高或过低、洗涤过于严格；⑤对照设计问题——阴性对照不严格导致假阳性结果；⑥检测手段问题——Western blot抗体不识别或质谱灵敏度不足。