在药物靶点发现的探索中，SM Pull Down、ABPP 等策略常通过将小分子药物改造成带有标记的探针，借助荧光成像或亲和富集来捕获靶蛋白。这类化学标记方法虽然应用广泛，却面临两道天然门槛：一是部分小分子结构复杂，难以在不破坏活性的前提下实现有效标记；二是引入标签后，分子的极性、构象及溶解度等理化性质往往随之改变，可能导致结合信号失真，甚至催生假阳性结果。正是基于此，无需对药物进行任何修饰的非标记鉴定技术，正成为补齐这一短板的重要途径。
钟鼎生物此前已依托药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）技术，为众多科研团队提供了非标记靶点鉴定服务。本文我们介绍另一种原理独立、同样无需标记的技术——细胞热转移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）。CETSA 通过定量检测药物结合后靶蛋白在活细胞内热稳定性的变化，实现了对胞内直接结合事件的无扰动测量。经过十余年的技术沉淀，CETSA 已被广泛视为活细胞层面靶点结合验证的“金标准”。CETSA与DARTS互为镜像，两者从"抗水解"和"抗热"两个维度共同验证靶点，使非标记靶点鉴定体系更加完善。
CETSA的核心逻辑简单而优雅：蛋白分子的空间结构在受热时容易“坍塌”变性，成为不可溶的聚集物。如果有一把小分子药物的“钥匙”精准地插入蛋白口袋，药物-蛋白复合物的结构会被“加固”，需要更高的温度才能让它“散架”。 具体而言，当小分子药物与靶蛋白结合后，会降低蛋白的自由能，使复合物的热稳定性显著高于游离蛋白。在随后进行的温度梯度实验中，未结合药物的游离蛋白在相对较低的温度下即发生热变性并沉淀析出，而药物-蛋白复合物则能在更高的温度下保持可溶构象。通过Western blotting或质谱技术，定量检测不同温度条件下溶液中剩余的可溶性蛋白含量，即可根据热熔解曲线的右移程度（即热转变中点Tm的升高），来证实药物与靶蛋白间的直接相互作用。
当面对“仅存蛋白、基因序列丢失”的珍贵杂交瘤细胞株、临床来源的天然抗体、免疫动物体内的多克隆抗体时，传统的依赖mRNA或参考数据库的测序方式往往束手无策。钟鼎生物的从头测序平台，正是为破解这类“无据可查”的困局而生。
可直接使用纯天然结构的化合物进行实验，避免因添加生物素、荧光基团等标签而改变药物构效关系，从源头减少假阳性或假阴性。
药物可与完整的活细胞共同孵育，在接近生理的环境下完成靶点结合的检测，给出的结合信息更具生理意义和临床转化价值。
从前期单一靶点的反向验证（CETSA-WB），到全蛋白质组的正向发现（CETSA-MS/TPP），再到高通量药物筛选（HT-CETSA）和体内组织靶点结合监测，CETSA均可作为核心技术方案。
既可以对目标蛋白进行精确定量（Western blotting模式），也可以与TMT标记定量质谱联用，在全蛋白质组范围无偏好地发现新靶点和脱靶蛋白。
药物与靶蛋白的结合在活细胞内完成并“锁定”后，整个检测过程不再依赖结合-解离的动态平衡维持，蛋白只要曾经被药物稳定化，其热抗性提升的信号就能被捕捉。
CETSA-WB仅需极小量的细胞样品（通常1×10⁶细胞即可完成一组完整温度梯度），不涉及复杂的亲和富集或分级分离步骤，蛋白损耗低，尤其适用于样本来源稀缺、培养困难的研究场景，极大拓展了靶点验证的适用范围。
1.Bruceine A protects nuclear receptor 4A1 from ubiquitin-degradation to alleviate mesangial proliferative glomerulonephritis（IF=52.7）
2025年12月，广州中医药大学第二附属医院潘胡丹/刘良院士团队与中国人民解放军总医院陈香美院士团队合作在 Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=52.7）上发表研究论文。该研究从公共数据中筛选出核受体NR4A1作为系膜增生性肾小球肾炎的关键靶点，并从中药鸦胆子中筛选到活性成分Bruceine A（BA）作为NR4A1的高亲和力分子。在靶点验证环节，研究团队利用CETSA-WB实验检测了BA与NR4A1在活细胞内的直接结合情况。实验方法为：将细胞经BA或对照处理后，在不同温度梯度下加热裂解，随后通过Western blot检测各温度下NR4A1蛋白的残留量。CETSA结果显示，BA处理组在更高温度下仍保留更多可溶性NR4A1蛋白，热熔解曲线明显右移。该结果明确证实BA在活细胞环境中能够直接结合并稳定NR4A1蛋白，且论文提供的CETSA-WB条带图和热熔解拟合曲线为靶点确认提供了坚实证据。
2.CETSA-MS-based target profiling of anti-aging natural compound quercetin（IF=10.4）
2024年， European Journal of Medicinal Chemistry（IF=10.4）上发表了一项关于槲皮素全蛋白质组靶点分析的研究。研究团队首先采用CETSA-MS策略，在全蛋白质组水平上筛选出37个热稳定性增强的蛋白和33个热稳定性降低的蛋白。随后，作者对其中的候选靶点进行了系统的CETSA-WB验证实验：通过Western blotting结合温度梯度处理，分别验证了槲皮素与CBR1蛋白（增强组）和MAPK1（降低组）的直接结合，并通过分子对接、定点突变和pull-down实验进行正交互证。该研究的一个亮点在于同时展示了CETSA-WB可检测到药物结合导致的不同热稳定性变化方向（正向和负向）。
想的温度梯度设置应该能恰好覆盖目标蛋白从完全折叠到完全变性的过程，有一个经典的设置思路可以参考：
①标准起始范围 (用于探索)：对于未知熔解温度（Tm）的蛋白，一个经典且稳妥的起始范围是从37℃开始，按5℃的间隔递增至67℃或更高（如：37、42、47、52、57、62、67℃）。这个范围能覆盖大多数蛋白质的变性温度区间。
②梯度数量 (8-10个)：为了绘制出一条平滑、可信的热熔解曲线，一般需要设置8-10个不同的温度点。点太少会导致曲线拟合不准确，影响ΔTm值的计算。
③精细优化 (针对已知Tm)：当通过预实验知道了目标蛋白的大致Tm后，可以围绕该温度缩小间隔（如2-3℃），进行更精细的扫描，以获得更准确的ΔTm值。
根据不同的实验通量和精度要求，主要有以下三类加热装置：
①标准梯度PCR仪：实验室标配，上手快。控温精准，能同时运行多个不同的温度，是经典CETSA（如CETSA-WB）的首选。适用于实验室常规的靶点验证，处理少量样品（如使用PCR管或96孔PCR板）。
②操作简单，成本低。适合样品量极少、只需比较几个特定温度点的初步实验。适用于极初步的探索性实验，或实验室没有PCR仪时的备选方案。
③专为CETSA优化，数据质量和通量极高。如双面加热的等温平台和梯度Peltier设备（GPD），能直接在标准微孔板上生成精准、均一的温度梯度，将假阳性率从31%大幅降至2%。适用于大规模药物筛选、需要处理成千上万个化合物的高通量实验，或追求最高数据质量的终极验证。
ABPP（Activity-Based Protein Profiling，基于活性的蛋白质组学分析） 和 CETSA 在药物靶点鉴定中确实是功能互补的“黄金搭档”。ABPP负责“发现”潜在靶点，CETSA负责在生理环境下“验证”小分子与这些靶点的真实结合。
推荐的技术衔接策略：如果你已经通过 ABPP 筛选出了几个候选靶蛋白，建议采用以下策略进行验证：
第一步：经典 CETSA (Western Blot 检测)：针对 ABPP 鉴定出的 1-2 个最关注的靶蛋白，使用 CETSA-WB 进行验证。在活细胞（或裂解液）中加入未经修饰的原药，进行热迁移实验，然后用特异性抗体检测该靶蛋白的熔解曲线。确认原药在细胞内确实与该蛋白结合（表现为 Tm 值右移）。
第二步：MS-CETSA (TPP) —— 可选：如果你希望通过 ABPP 发现的是新靶点，且希望排除脱靶效应，可以考虑 MS-CETSA。结合质谱进行全蛋白质组的热稳定性分析。不仅能验证 ABPP 发现的靶点，还能同时观察药物对其他上千种蛋白的影响，确认该药物是“选择性”结合目标靶点，还是存在其他未知的脱靶效应。
①不是。 虽然这是最常见的情况，但存在明显的例外。药物结合导致热稳定性降低（即 destabilization）的情况也时有发生，甚至不变化也是一种有价值的阴性结果。
②通常是的，但严格来说，是“信号更强”，而不是“条带更粗”。 在理想的阳性结果中，你会观察到在特定温度点（如60-65℃），加药组的Western Blot条带信号强度显著高于未加药组。
①初步验证靶点结合的热熔解曲线模式（CETSA-WB）:药物浓度通常设置为单浓度即可。具体做法是将细胞或细胞裂解液分为实验组和对照组，实验组加入适量药物溶液孵育（裂解液形式的CETSA实验中，终浓度一般设置为200 μM，或参考相关文献中该药物的有效剂量进行调整），对照组加入等体积的DMSO或药物溶剂作为阴性对照。实际操作中，DMSO的终浓度应控制在不影响细胞生长和蛋白稳定性的范围（通常不超过0.1%），以避免溶剂毒性干扰实验结果。部分protocol中也常用3 μM和30 μM两个浓度进行实验，以观察靶蛋白热稳定性是否呈浓度依赖性增强，从而提供更有说服力的结合证据。
②用于定量测定结合亲和力的等温剂量反应模式（ITDR-CETSA）：通常先通过热熔解曲线确定使靶蛋白约50%变性的温度点（即Tm值附近），然后在此恒定温度下，将药物进行系列浓度稀释。例如，可以设置6个浓度点的连续稀释方案（如800 μM、400 μM、100 μM、10 μM、1 μM及0 μM），检测不同药物浓度下靶蛋白可溶性残留量的变化，从而绘制药物浓度-蛋白热稳定性曲线，计算半数有效浓度（EC₅₀）值。这种等温剂量反应实验能够提供药物与靶蛋白结合的定量亲和力数据。
你需要做两组关键实验，共设置至少12个数据点（7个温度×2个浓度）以及3类对照，才能构成一份足以让审稿人信服的完整证据。