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BLI（Bio-Layer Interferometry，生物膜干涉技术）是新一代的非标记（label-free）实时检测技术。它用光纤传感器尖端的生物膜层对光的干涉来"读出"分子结合——配体固定在传感器表面，分析物结合上去，膜层厚度变化，干涉光谱位移，信号就此产生。相比 ELISA，它不需要标记、不需要洗板、不需要对抗体做梯度，1 小时左右就能给出结合曲线。本文把 BLI 实验中最常被问到的六个问题逐一拆开讲清楚：固化方法怎么选、能提供哪些信息、比 ELISA 强在哪、样品有什么要求、能研究哪些分子、非特异性结合怎么排查。
📋 本文内容速览
- BLI 原理速览：光纤、生物膜层与光干涉
- Q1：BLI 实验中固化方法有哪些？各有什么优劣势？
- Q2：BLI 技术可以提供哪些信息？
- Q3：BLI 技术相对 ELISA 方法具有哪些优势？
- Q4：BLI 实验需要的样品有哪些要求？
- Q5：BLI 可研究的生物分子范围与可检测亲和力区间
- Q6：BLI 实验中遇到非特异性结合怎么办？
- 常见问题解答（FAQ）
PART 00BLI 原理速览：光纤、生物膜层与光干涉
BLI 的核心是一个"会读光的探针"：光纤传感器尖端有一层生物膜（matrix），配体（ligand）固定在这层膜上；当分析物（analyte）结合上来时，膜层厚度与密度发生变化，反射光形成的干涉光谱随之位移。仪器实时记录这种位移，就得到了结合与解离的曲线——这就是常说的传感图（sensogram）。
分析物 Analyte随浓度梯度结合
配体 Ligand固化在传感器表面
生物膜层 Matrix光干涉发生的位置
光纤传感器 Fiber反射光返回检测器
配体固定
→
分析物结合
→
膜层厚度变化
→
干涉光谱位移
→
实时曲线
▲ BLI 传感器层次与检测链条示意：分析物结合引起膜层变化，最终被转化为可记录的光谱位移
1
基线 Baseline
缓冲液流经传感器，信号应平稳；基线不平说明体系尚未平衡或缓冲液不匹配。
2
结合 Association
分析物结合到配体上，信号上升，上升快慢反映结合速率常数 ka。
3
解离 Dissociation
切换回缓冲液，分析物解离，信号下降，下降快慢反映解离速率常数 kd。
4
再生 Regeneration
洗去分析物使传感器回到基线，决定同一根传感器能否重复使用。
▲ 一条传感图由 基线 → 结合 → 解离 → 再生 四个阶段构成，KD = kd / ka 就是由结合与解离两段拟合得到的
"无标记"到底省掉了什么：ELISA 需要把抗体或抗原酶标、洗板、加底物显色，每一步都可能引入误差；BLI 直接测量"结合事件本身"引起的物理信号变化，不需要任何标记二抗，也就避免了标记效率差异、二抗交叉反应、洗板不彻底等干扰。信号来自结合，而不是来自显色——这是 BLI 与传统免疫检测方法的根本区别。
Q1BLI 实验中固化方法有哪些？各有什么优劣势？
BLI 实验的第一步，是把配体"固定"到传感器表面，这一步叫固化（immobilization）。固化方式的选择，直接决定了后面结合曲线的质量、活性保持程度和再生难度。常见方式分为直接固化与抓取固化两大类。
▲ BLI 固化方式示意（直接固化与抓取固化）
| 对比维度 | 直接固化 | 抓取固化 |
|---|---|---|
| 优势 | 非常稳定的固化；所有蛋白都可以进行固化 | 不会产生共价键，易于保持蛋白活性；可以固化粗样品中的蛋白；固化的有序性；将固化蛋白与分析蛋白一并再生，回传到传感器原始状态 |
| 劣势 | 需要纯化的蛋白；无序的固化；产生共价键，可能对蛋白活性有影响；再生时需要考察固化蛋白的耐受性 | 固化的密度少于前者；固化稳定性弱于前者 |
| 典型适用 | 纯化好的稳定蛋白、需要反复再生的长期项目 | 活性敏感蛋白、粗样品、抗体 Fc / 生物素 / His 标签体系 |
选择固化方式时先问三个问题：①配体是纯化好的还是粗样品？②配体的活性对共价修饰敏感吗？③这根传感器需要重复使用很多次吗？——粗样品、活性敏感、对再生次数要求不高，选抓取固化；纯化好、需要长期反复再生，选直接固化。
抓取固化的一个隐藏优势：抓取固化把"配体固定"和"分析物结合"放在同一条链上，分析物解离后可以连同配体一起洗掉、让传感器回到原始状态，再重新抓取新的配体。这让同一批传感器可以轮换测试不同的配体，特别适合抗体配对筛选这类需要"换着来"的场景。
Q2BLI 技术可以提供哪些信息？
BLI 不是只回答"结合没结合"，它一次实验可以同时给出四个层面的信息：
① 分子特异性结合
目标分子之间是否存在特异性结合？回答的是"有没有"。
② 结合亲和力 Affinity
分子结合的紧密程度？用 KD、KA 衡量，可用于候选分子排序。
③ 结合动力学 Kinetics
分子互作反应的速度？用结合速率 ka 与解离速率 kd 衡量。
④ 浓度分析
目标分子有多少？基于结合速率与标准曲线反推浓度。
KD、KA、ka、kd 之间是什么关系：结合是"配体 + 分析物 ⇌ 复合物"，正向速率常数为
ka（单位 M⁻¹s⁻¹），逆向速率常数为 kd（单位 s⁻¹），平衡解离常数 KD = kd / ka（单位 M），平衡结合常数 KA = 1 / KD。KD 越小，结合越强；KD = 1 nM 意味着在 1 nM 浓度下约有一半配体被结合。
为什么"只看 KD 不够"：两个抗体可能 KD 相同，但一个 ka 快、kd 也快（结合快解离快），另一个 ka 慢、kd 也慢（结合慢解离慢）。在需要长时间占据靶点的场景（如体内治疗），kd 更小的分子往往更有优势；在需要快速响应的场景，ka 也很关键。所以动力学参数要和亲和力一起看。
Q3BLI 技术相对 ELISA 方法具有哪些优势？
BLI 与传统 ELISA 的差异，不只是"快慢"，而是检测逻辑不同：ELISA 靠酶促显色间接反映结合，BLI 直接读取结合事件。下表是两者在实验层面的逐项对比：
| 对比项 | ForteBio（Octet RED96e） | ELISA |
|---|---|---|
| 时间 | 1 小时 | 4-8 小时，抗体标记不计 |
| 是否需要标记 | 否 | 是 |
| 自动化程度 | 高 | 低 |
| 样品是否可以重复使用 | 是 | 否 |
| 抗原耗量 | 1-5 μg | 10 μg |
| 是否有配套分析软件 | 是 | 否 |
| 抗体是否做梯度 | 否 | 是 |
| 弱亲和力配对 | 是 | 否 |
| 是否可实现粗样品配对 | 是 | 否 |
BLI 最"值"的三个优势：①无需标记——省掉二抗标记与交叉反应干扰；②样品可重复使用——珍贵样品测完还能回收；③可实现粗样品配对——细胞上清、腹水等未经纯化的样品也能直接上机，抗体筛选用它比 ELISA 省时省样。
不要把 BLI 当成"ELISA 的升级版"：ELISA 在定量检测（如血清抗体滴度、夹心法测浓度）上有成熟的标准化体系与试剂盒生态；BLI 擅长的是实时互作与动力学表征。两者是互补关系，很多项目是"BLI 做亲和力排序、ELISA 做定量确认"。
Q4BLI 实验需要的样品有哪些要求？
BLI 对样品的要求，可以归纳为"均一、够纯、够浓、缓冲液兼容"八个字。下表按四个维度逐项列出：
| 样品的均一性 | 蛋白理化性质 | 缓冲液成分 | 亚型 / 标签类型 |
|---|---|---|---|
| 确保样品充分水溶，样品中没有任何沉淀、颗粒——保持样品处于均一的、不聚集的状态 | 纯度 >90%，蛋白浓度 >0.2 mg/mL，浓度越高越好；需明确等电点 / 分子量信息 | 分析物样品中不能含有高浓度的高聚物物质如 PEG 等；氨基偶联的配体溶液中不能含有 Tris、NaN3、甘氨酸等成分；APS 传感器（膜蛋白相互作用研究）的固化缓冲液不得含有任何去污剂 | 如果配体或分析物是抗体，请告知抗体亚型及种属；如果配体或分析物是蛋白，请告知标签类型 |
兼容性好的缓冲液成分
- PBS、HEPES、MES 等常规缓冲体系
- 适当浓度的 NaCl 用于维持离子强度
- 0.005%-0.05% 的 Tween-20（非离子型）
- 1-2% BSA 用于封闭与降低非特异吸附
需要避开或提前告知的成分
- 高浓度 PEG 等高聚物，会干扰光学信号
- Tris、NaN3、甘氨酸，会干扰氨基偶联
- 任何去污剂，会破坏 APS 传感器膜体系
- 高浓度还原剂（如 DTT、β-巯基乙醇）
配体与分析物的缓冲液要"匹配"：BLI 对折射率/基质效应敏感，配体缓冲液与分析物缓冲液如果差异过大，基线会出现明显漂移，甚至被误判为"结合信号"。建议两者使用相同的基础缓冲液，或至少保证盐浓度、pH 与去污剂浓度接近。
样品前处理的实用建议：上机前离心（如 12000 rpm、10 min）或 0.22 μm 过滤去除颗粒与沉淀；蛋白样品避免反复冻融，可分装后单次使用；粗样品（如细胞上清、腹水）建议先做缓冲液交换，减少培养基成分干扰。这些动作看似琐碎，却是"基线稳不稳"的关键。
Q5BLI 可研究的生物分子范围与可检测亲和力区间
BLI 可研究的生物分子范围较广：蛋白质、DNA/RNA、脂类 / 脂质体 / 生物膜、多糖、多肽、小分子、全细胞 / 病毒 / 微生物。这也是它在基础研究与药物发现中应用广泛的原因之一。
▲ BLI 可研究的生物分子范围示意
钟鼎目前可以检测的亲和力范围：
← 结合弱
结合强 →
蛋白与小分子结合：10⁻³ ~ 10⁻⁶ M
较弱的抗原-抗体结合：10⁻⁶ ~ 10⁻⁷ M
强的抗原-抗体结合 / DNA 与蛋白结合：10⁻⁸ ~ 10⁻¹⁰ M
亲和素-生物素结合：10⁻¹⁴ M（近乎不可逆）
较弱的抗原-抗体结合：10⁻⁶ ~ 10⁻⁷ M
强的抗原-抗体结合 / DNA 与蛋白结合：10⁻⁸ ~ 10⁻¹⁰ M
亲和素-生物素结合：10⁻¹⁴ M（近乎不可逆）
怎么读这张标尺：KD 是解离常数，数值越小表示结合越强、解离越慢。10⁻³ M 属于毫摩尔级弱结合（常见于小分子与蛋白），10⁻¹⁴ M 属于飞摩尔级超强结合（亲和素-生物素是自然界最强的非共价互作之一）。项目里常说的"nM 级抗体"指的就是 KD 在 10⁻⁹ M 附近。
超出可检测范围怎么办：如果 KD 太弱（>10⁻³ M），结合曲线几乎看不到明显上升，需要提高分析物浓度或改用竞争法；如果 KD 太强（<10⁻¹⁴ M），解离极慢，常规解离阶段几乎"平线"，需要延长解离时间或改用更严格的再生条件。遇到这类边界情况，建议先与实验人员沟通调整方案。
Q6BLI 实验中遇到非特异性结合怎么办？
在 BLI 实验中，通常的非特异性结合（NSB）有两类：
① 分析物直接与固相介质结合
分析物与传感器表面发生非特异吸附，而不是与配体结合。表现为：没有配体的空白传感器上也出现信号上升。
② 缓冲液杂质与固化物结合
分析物缓冲液中的杂质与配体或基质结合。表现为：换用同浓度缓冲液对照时，信号同样上升。
▲ 两类非特异性结合的判断思路：空白传感器对照 + 缓冲液对照，是区分二者的关键
▲ 不同种类的非特异性结合示意
改善或消除非特异性结合的方法有以下几种，可以根据具体情况进行尝试：
1优化反应缓冲液
第一种是摸索合适的 pH 条件；提高盐离子浓度；第二种是增加表面活性剂的浓度，非离子型如 Tween-20，最高至 0.05%。
2增加一步封闭
在反应缓冲液中加入 BSA，浓度 1-2%；如果 BSA 有干扰，可以用其他封闭缓冲液替代，如 PEG、脱脂奶粉替代或其他市售封闭缓冲液。
3尽可能提高分析物的纯度
去除杂质，减少缓冲液中杂蛋白与固化物结合带来的假信号。
4固化物和分析物尝试对换
如果某一方向非特异吸附严重，交换固定端与分析物端往往能显著改善信噪比。
5SA/SAX/SSA 传感器的残留位点封闭
当使用 SA/SAX/SSA 生物传感器时的 NSB，可以在生物素化的捕获分子固化到传感器上后，用 biocytin 封闭残留的链霉亲和素位点。
6血清样品的基线处理
当使用血清样品时的 NSB，可以在血清样品结合之前使用相同浓度的阴性血清作为基线。
排查顺序建议：先做空白传感器对照（不加配体，只走分析物）判断是否为介质吸附；再做缓冲液对照（不加分析物，只走缓冲液）判断是否为缓冲液成分干扰。两类对照都能区分清楚之后，再按"调缓冲液 → 加封闭 → 提纯度 → 换方向"的顺序逐项优化，不要一次性改太多变量。
不要把"信号强"当成"结合好"：非特异吸附也会产生很强的信号，而且往往出现在空白传感器或无关配体上。判断特异性结合的关键是对照——空白传感器无信号、无关配体无信号、只有目标配体有信号，才是真的结合。只看绝对信号高低，很容易被非特异吸附误导。
与 SPR 的对照思路：如果 BLI 上非特异吸附始终压不下去，可以尝试用 SPR 技术做平行验证。SPR 有流路系统，可以通过参考通道实时扣除体相折射率变化，对某些"难搞"的样品体系有时能给出更干净的基线。两种技术互补使用，能更快定位问题来源。
FAQ常见问题解答
BLI实验中固化方法有哪些？各有什么优劣势？
BLI的固化方法主要分为两类。直接固化：通过共价偶联等方式把配体直接固定在传感器表面，优势是非常稳定、所有蛋白都可以固化；劣势是需要纯化蛋白、固化无序、共价键可能影响蛋白活性、再生时需要考察固化蛋白的耐受性。抓取固化：先用生物素化、His标签、Fc标签等捕获试剂把配体“抓”到传感器上，优势是不产生共价键、易于保持蛋白活性、可固化粗样品中的蛋白、固化的有序性好，且固化蛋白与分析蛋白可一并再生回到传感器原始状态；劣势是固化密度低于直接固化、固化稳定性弱于直接固化。选择时需权衡“活性保持”与“固化稳定性”。
BLI技术可以提供哪些信息？
BLI可提供四类信息：①分子特异性结合——目标分子之间是否存在特异性结合；②结合亲和力（Affinity）——分子结合的紧密程度，用KD、KA衡量，可用于候选分子排序；③结合动力学（Kinetics）——分子互作反应的速度，用结合速率常数ka与解离速率常数kd衡量；④浓度分析——目标分子有多少。这四类信息分别对应“有没有结合、结合得多紧、结合得多快、结合了多少”四个层面的问题。
BLI技术相对ELISA方法具有哪些优势？
BLI相对ELISA的主要优势包括：检测时间短（约1小时 vs 4-8小时，且不计抗体标记时间）；无需标记；自动化程度高；样品可重复使用；抗原耗量低（1-5 μg vs 约10 μg）；有配套分析软件；无需对抗体做梯度稀释；可检测弱亲和力配对；可实现粗样品配对。这些优势使BLI在抗体筛选、亲和力排序和动力学表征中效率明显更高。
BLI实验需要的样品有哪些要求？
样品要求主要包括四个方面：①均一性——确保样品充分水溶，无沉淀、无颗粒，保持不聚集状态；②蛋白理化性质——纯度>90%，蛋白浓度>0.2 mg/mL且越高越好，需明确等电点与分子量信息；③缓冲液成分——分析物样品中不能含有高浓度高聚物（如PEG），氨基偶联的配体溶液不能含Tris、NaN3、甘氨酸等，APS传感器固化缓冲液不得含任何去污剂；④亚型/标签类型——若配体或分析物是抗体需告知亚型与种属，若是蛋白需告知标签类型。
BLI可研究的生物分子范围有哪些？钟鼎目前可检测的亲和力范围是多少？
BLI可研究蛋白质、DNA/RNA、脂类/脂质体/生物膜、多糖、多肽、小分子以及全细胞/病毒/微生物。钟鼎目前可检测的亲和力范围包括：亲和素-生物素结合约10^-14 M；强的抗原-抗体结合约10^-8至10^-10 M；DNA与蛋白结合约10^-8至10^-10 M；较弱的抗原-抗体结合约10^-6至10^-7 M；蛋白与小分子结合约10^-3至10^-6 M。KD数值越小表示结合越强。
BLI实验中遇到非特异性结合怎么办？
BLI中的非特异性结合通常有两类：分析物直接与固相介质（传感器）结合；分析物缓冲液中的杂质与固化物结合。改善或消除的方法包括：①优化反应缓冲液，摸索合适pH、提高盐离子浓度、增加非离子型表面活性剂（如Tween-20最高至0.05%）；②增加封闭步骤，在缓冲液中加入1-2% BSA，若有干扰可改用PEG、脱脂奶粉或其他市售封闭液；③尽可能提高分析物纯度、去除杂质；④固化物与分析物尝试对换；⑤使用SA/SAX/SSA传感器时，可在生物素化捕获分子固化后用biocytin封闭残留链霉亲和素位点；⑥使用血清样品时，可在血清结合前用相同浓度阴性血清作为基线。
BLI与SPR有什么区别？应该怎么选？
BLI基于光纤传感器尖端生物膜层的光干涉，SPR基于金属膜表面折射率变化，两者都是无标记实时检测技术。BLI的优势在于传感器一次性使用、无流路交叉污染、可耐受粗样品、通量高、操作简便；SPR的优势在于灵敏度更高、可精确测定极慢解离速率、基线更平稳。实际选择上，抗体筛选、粗样品配对、高通量排序优先考虑BLI；需要极低浓度检测、精细动力学常数测定时优先考虑SPR。很多项目会用BLI做初筛、SPR做精确定量。
传感图（sensogram）怎么看？基线漂移和结合曲线异常怎么办？
典型传感图包含基线、结合、解离、再生四个阶段：基线平稳说明体系稳定；结合阶段信号上升反映结合速率ka；解离阶段信号下降反映解离速率kd；再生阶段回到基线说明传感器可重复使用。基线持续漂移常见原因是缓冲液不匹配、传感器未平衡、样品中有颗粒或气泡；结合曲线出现异常抬升或“钩状”多因非特异性结合；解离阶段异常快速下降多因配体从传感器脱落（抓取固化尤为常见）。建议先做缓冲液匹配与传感器预平衡，再排查样品纯度与非特异性吸附。
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