想直接"看见"两个蛋白在细胞里是否相遇？BiFC 就是为此而生的技术。双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）技术服务是钟鼎生物在生物大分子互作研究领域新增加的服务内容。本文系统介绍 BiFC 的原理、优缺点、烟草体系实验流程、注意事项，并与酵母双杂交、Co-IP、GST pull-down 等方法对比，供大家参考。
- BiFC 原理：荧光蛋白片段的重组互补
- BiFC 技术的优缺点与应用场景
- BiFC 与其他蛋白互作方法的对比
- BiFC 烟草体系实验流程（7 步）
- BiFC 实验注意事项
- BiFC 实验设计要点与假阳性排查
- 常见问题解答（FAQ）
在荧光蛋白（YFP、GFP、Luciferase 等）的两个 β 片层间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基因而发出荧光。
无荧光活性
无荧光活性
发出荧光信号
| 优点 | 缺点 | 应用 |
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蛋白互作研究有多种技术，选择哪种取决于实验目的、样本材料和验证需求。下表对常用方法进行对比。
| 方法 | 实验类型 | 核心优势 | 主要局限 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|
| BiFC | 体内/体外可视化 | 可直接观察互作及亚细胞定位 | 不可逆，对温度敏感 | 验证已知互作、定位研究 |
| 酵母双杂交 | 体内遗传学 | 可筛选未知互作蛋白 | 假阳性较高，需验证 | 文库筛选、点对点验证 |
| Co-IP | 体内/体外生化 | 可捕获内源蛋白复合物 | 需要特异性抗体 | 验证内源互作、复合物组分 |
| GST pull-down | 体外生化 | 操作简单、成本低 | 无法反映体内状态 | 验证直接互作、互作结构域 |
| MST | 体外定量 | 可定量测定亲和力 | 需纯化蛋白 | 互作强度定量、参数测定 |
以烟草体系为例，在烟草植株活体细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用。
25℃培养4-5周
EHA105等菌株
培养2天
至OD600=0.5-0.6
OD600=1.0静置
叶片背面注射
共聚焦显微镜
在 14 h 光照/10 h 黑暗，温度 25℃，相对湿度 70% 条件下培养大概 4~5 周。
GV3101、EHA105、LBA4404 这三种农杆菌均有报道可以用于烟草瞬时转化。在培养农杆菌时候除了添加载体所含有的抗生素外，不同农杆菌还需要添加其它种类抗生素，比如 GV3101 还需要添加 50 μg/ml 的利福平。
挑取含有目的载体的农杆菌单克隆至含有相应抗生素的 5 ml LB 培养基中，在 28℃，200 rpm 的条件下培养 2 d。（新鲜转化的农杆菌单克隆在 3 mL 培养基培养过夜至 1 d 即可。）
转移 1 ml 培养的农杆菌菌液至 20 ml 含有相应抗生素的 LB 培养基中扩大培养，该 LB 培养基含 15 μM 乙酰丁香酮。在 28℃，200 rpm 的条件下培养至农杆菌的生长对数期（OD600=0.5-0.6）。
在室温，5000 rpm 离心 10 min 以收集菌体，用浸染液（含 10 mM MgCl2，10 mM MES，150 μM 乙酰丁香酮，pH = 5.6）悬浮农杆菌菌体至 OD600 = 1.0。室温静止 2~3 h。（至少 0.5 h，至多不超过 3 h。）
等体积混合两种含有不同质粒的菌体，用 1 ml 的针头在烟草叶片背面轻轻点开一个小口（注意不要刺穿），再用去掉针头的针管吸取菌液，从叶片伤口处注射到叶片中。用记号笔标记烟草叶片水溃状区域。
注射过的植株于 21℃ 左右培养 2 d 后观察烟草注射农杆菌的区域有无荧光。撕取烟草叶片标记区域（可以不撕，直接用刀挖出靠近伤口的叶片部分即可）用激光共聚焦显微镜进行荧光的成像（叶片背面表皮细胞层较好观察）。
太小的叶片可能注射不进去，太老的叶片表达效率较低。叶片气孔打开的时候比较容易注射，因此最好在白天注射。
OD600 = 1.0 并不一定适用于所有的基因，高浓度可能导致叶片死亡，或者影响定位结果。建议设置不同的浓度梯度进行比较，在可以获得荧光信号的前提下尽量采用低浓度的菌液。
这一点在单转做亚细胞定位的时候表现得特别明显，效率高者基本每次都能达到 100% 发光，低者可能转 10 次只能表达出一两次。建议在 BiFC 之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。
但不同基因表达的时间可能在 1-7 天不等。建议在注射后 2 d、3 d、5 d 分别观察一次，确定最佳观察时间点。
BiFC 结果的可靠性高度依赖实验设计的严谨性。以下要点是获得可信数据的关键。
至少设置三组对照：①N端片段融合蛋白A + 空C端片段；②空N端片段 + C端片段融合蛋白B；③N端片段融合无关蛋白 + C端片段融合无关蛋白。只有实验组有荧光、对照组无荧光，结果才可信。
过表达可能导致荧光蛋白片段非特异性靠近，产生假阳性。建议通过调整农杆菌浓度或使用弱启动子来控制表达水平。
如果 BiFC 信号来自真实的蛋白互作，那么交换 N/C 端片段（即蛋白A-C端 + 蛋白B-N端）应仍然有信号。如果只有一种组合有信号，需要考虑空间位阻或假阳性的可能。
用 Co-IP、GST pull-down 或酵母双杂交对 BiFC 结果进行独立验证。多种方法结论一致，可信度才高。
与其它研究蛋白与蛋白相互作用技术相比，双分子荧光互补（BiFC）是一种简单、快捷的方法，拥有广阔的应用前景。钟鼎生物能够提供双分子荧光互补检测服务，高效跟踪蛋白质互作，助力科研，欢迎咨询。
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