SYBR Green I 方法是目前最为常见的荧光染料法，其作用原理为：SYBR Green I 是一种只与双链 DNA 小沟结合的染料，并不与单链 DNA 链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入 DNA 双链中才可以发光。因此，在 PCR 体系中，随着特异性 PCR 产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链 DNA 中，其荧光信号强度与 PCR 产物的数量呈正相关。

图1 SYBR Green I 染料法原理

在 PCR 过程中，SG 染料只有在延伸阶段形成双链时，才通过和双链 DNA 的小沟结合，在激发情况下发出荧光，在变性和退火的单链状态时，不能发出荧光。荧光量与产物中双链的量呈正相关。游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，一旦与 dsDNA 结合，其荧光可增加约 1000 倍。

基于 SYBR Green I 染料法的荧光定量 PCR 的最大优点是通用性强，适用于所有的荧光定量 PCR 反应，同时，其缺点也在于其非特异性。当 PCR 反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。但是通过对 PCR 产物的熔解曲线进行分析，使非特异性扩增的问题得以解决，从而保证荧光信号的特异性。

Tm 值的概念：Tm 为 DNA 解链一半时的温度，不同的双链 DNA 由于其碱基组成不同，长度不同，因此 Tm 值也不同，据此可以判断是否获得同一 PCR 产物。

图2 溶解曲线分析：左图为特异性扩增（单峰），右图出现非特异峰

结合有染料的双链 DNA 随温度的升高逐步解链后不再结合染料，因此，荧光强度（纵坐标）随温度（横坐标）的升高而减弱。将温度与荧光强度的变化求导（-dI/dT），即得 Tm 值，对应图中的熔解曲线峰图。左图表明产物的特异性，右图熔解曲线分析出现非特异峰，说明有引物二聚体或者非特异扩增，导致定量不准确。

做 qPCR 的人都知道，第一个要做的决定不是用什么模板、什么引物，而是到底用 SYBR Green 还是 TaqMan 探针。这个选择没做对，后面所有的努力都可能白费。

引物二聚体是 SYBR Green I 法中最常见的问题之一。过度稀释的模板及模板空白对照均有引物二聚体产生。引物二聚体是引物自身退火形成的小片段非特异性产物，通常表现为较低熔解温度（一般 <80℃）的峰。

标准曲线是评估 qPCR 反应效率和线性范围的核心工具。标准曲线应包括至少 5 个不同浓度的标准品，每个浓度做三个重复，稀释梯度的浓度范围应能涵盖预期目标样本的浓度。

MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）指南为 qPCR 实验的发表提供了最低限度的信息标准。对于 SYBR Green I 实验，MIQE 要求必须报告 NTC 的 Cq 值、溶解曲线分析结果以及引物的验证数据。

SYBR Green I 染料法因其成本低、通用性强的特点，在以下场景中具有广泛的应用价值：