实时荧光定量PCR在科研、诊断、医疗等众多领域得到了广泛的应用。根据实验目的定量分析类别，其应用大致可划分为三类：绝对定量的应用领域、相对定量的应用领域，以及荧光定量PCR实验的规范化和精细化发展趋势。本文聚焦相对定量的两大核心应用领域——基因的表达研究和microRNA定量分析，并附上miRNA定量检测的完整操作流程与内参基因选择策略。
- 相对定量的核心逻辑与工作流
- 应用一：基因的表达研究
- 应用二：microRNA定量分析
- miRNA定量检测完整操作流程（提取→反转录→qPCR）
- 内参基因选择策略
- 常见问题解答（FAQ）
相对定量的分析结果，是在相当量的实验组（样品A）和对照组（样品B）中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。与绝对定量需要标准曲线不同，相对定量关注的是"变化了多少倍"，而不是"绝对有多少拷贝"。
提取总RNA
（或miRNA cDNA）
采集Cq值
- Cq内参
表达倍数差异
核心公式：相对表达量 = 2-△△Cq，其中 △△Cq = △Cq（实验组）- △Cq（对照组），△Cq = Cq（靶基因）- Cq（内参基因）。对照组表达量定为 1（或 100%），实验组表达量即为相对倍数变化。前提是靶基因与内参基因的扩增效率相近且接近 100%。
qPCR 方法能检测各种组织细胞中基因的表达水平，从而分析基因的表达调控，监控 mRNA 表达模式。
1. 组织特异性转录分析：定量分析基因在不同组织中的转录水平，揭示组织特异性的表达模式。
2. 处理条件响应研究：研究各种处理（药物、物理、化学等）对细胞 mRNA 含量变化的影响，追踪基因表达的动态变化。
3. 肿瘤标志物分析：通过比较正常组织与肿瘤早期和良性阶段就可出现的癌基因的 mRNA 含量变化，对于肿瘤的早期诊断、治疗效果及预后的判断进行有效分析。这类研究通常需要严格的对照设计和多组重复，才能在复杂的生物背景中捕捉到有统计意义的表达差异。
实验设计提示：基因表达研究通常需要至少 3 个生物学重复，每个样本做 3 个技术复孔。内参基因的选择至关重要——建议在正式实验前用 geNorm、NormFinder 等工具评估候选内参基因的稳定性，避免"照搬"实验室常用内参导致结果偏差。
microRNA 对机体在应激、感染、癌症和辐射各方面的调节作用已经得到肯定，并且在临床诊断和治疗中的应用具有巨大的前景。实时定量 PCR 检测系统的出现，对于 microRNA 检测技术和表达量分析有着巨大的优势。
主要技术优势：
可以针对成熟 microRNA 进行定量，之后又分别针对成熟 microRNA 分子和前体分子进行定量。
仅需 1~10 ng 的总 RNA 或 50 pg 左右的 microRNA 即可完成检测。
可跨越 7 个数量级，利用 U6 等内参基因，在 microRNA 的定量分析中已日益成熟。
| 试剂盒品牌 | 核心技术 |
|---|---|
| ABI | 利用茎环探针技术 |
| Exiqon | 利用锁核酸（LNA）的特异性引物和 SYBR Green I 染料法 |
| Qiagen 等 | 原理各不相同，可根据实验目的选择 |
为什么 miRNA 检测特别依赖技术平台？miRNA 长度仅 18-25 nt，常规引物难以设计。茎环法逆转录（ABI）和锁核酸（LNA）技术（Exiqon）通过分别延长逆转录产物和提升短探针 Tm 值，解决了 miRNA 定量的核心难题。选择试剂盒时，需根据样品量、目标 miRNA 丰度和预算综合权衡。
以鉴定 miRNA 过表达稳定细胞系为例，简要阐述利用 Exiqon 公司的 miRNA 反转录和定量试剂盒对 miRNA 定量检测的步骤。
针对单层培养细胞，每 6 cm² 培养皿细胞加 0.7 mL QIAzol Lysis Reagent 溶液。上述样品振荡 10 s 后室温放置 5 min。加入 0.4 mL 三氯甲烷溶液，剧烈振荡 15 s，室温放置 2~3 min。12000 g，4℃ 离心 15 min。小心将上层水相加入一个新的 EP 管中，加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇后吹打混匀，将混合液加入 RNeasy Mini 柱子中，8000 g 室温离心 15 s，弃废液，加入 0.7 mL Buffer RWT，8000 g 室温离心 15 s，弃废液，用 0.5 mL Buffer RPE 清洗柱子两次，将柱子放入一支新的 EP 管中，12000 g 室温离心 1 min，晾干柱子 5 min，将柱子放入新 EP 管中，加入 30~50 μL 无 RNase 水，12000 g 室温离心 2~3 min，收集洗脱液即为 RNA。
取总 RNA 4 μL（20 ng），加入 5× 反应缓冲液 4 μL、Enzyme mix 2 μL、无 RNA 酶水 10 μL，加入 PCR 管中。设置 PCR 仪，42℃ 反应 1 h，95℃ 灭活 5 min，利用试剂盒提供的特异反转录引物获得 cDNA。
内参基因 U6 和特异基因 miR-410 引物购自 Exiqon 公司。按下列组分配制 PCR 反应液（20 μL 体系）：10 μL 2× QuantiTect SYBR Green Master Mix、1 μL cDNA（100 ng）、1 μL 混合引物（10 pmol/L）、8 μL DEPC 水。将样品加入到 Real-time PCR 的专用 PCR 管中后，设置 PCR 反应条件为：95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，45 个循环。完成 Real-time PCR 后对其熔解曲线进行分析。数据按 2-△△Cq 公式计算出基因表达的相对量。
操作提示：miRNA 提取过程中需特别注意避免 RNA 酶污染。反转录时使用试剂盒提供的特异茎环引物，而非随机引物或 Oligo-dT。qPCR 完成后务必分析熔解曲线，确认扩增产物为单一特异性产物，排除引物二聚体和非特异性扩增的干扰。
相对定量的结果是否可靠，内参基因的选择至关重要。没有哪个内参基因是"万能"的，不同组织、不同处理条件下，内参基因的稳定性可能完全不同。
| 内参基因 | 适用场景 | 注意事项 |
|---|---|---|
| GAPDH | 常规基因表达研究，组织样本 | 在缺氧、糖尿病等条件下表达可能变化 |
| ACTB | 常规基因表达研究 | 细胞骨架相关，某些处理下表达波动较大 |
| 18S rRNA | 总 RNA 分析 | 丰度极高，可能掩盖靶基因信号 |
| UBQ / TUBB | 多种组织样本 | 稳定性较好，可作为备选内参 |
| U6 | microRNA 定量检测专用 | 核内小 RNA，是 miRNA 研究的经典内参 |
内参筛选工具：建议在正式实验前，用 geNorm、NormFinder 或 BestKeeper 等工具评估 3-5 个候选内参基因的稳定性，选择最稳定的 1-2 个作为内参。如果找不到单一稳定内参，可以考虑使用多个内参基因的几何平均值。
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