绝对定量获得的是样品的绝对拷贝数，通常应用于一些需要精确拷贝数研究和应用方面的领域。与相对定量回答"差多少倍"不同，绝对定量回答的是"到底有多少"——这个数值本身就具有诊断或判定意义。本文围绕三大核心应用领域展开：病原体拷贝数定量分析、核酸药物药代动力学评价、转基因产品检测，并分别以 HBV DNA 检测、DNA 疫苗生物分布研究和 Bt176 转基因玉米检测为例，详细阐述操作流程。
- 绝对定量的核心逻辑与工作流
- 应用一：病原体拷贝数定量分析（HBV DNA 检测）
- 应用二：核酸药物开发与评价（DNA 疫苗生物分布）
- 应用三：转基因产品检测（Bt176 转基因玉米）
- 常见问题解答（FAQ）
绝对定量的分析结果是通过样品的 Cq 值和标准曲线进行比较实现的，结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞、每微克总 RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。
或体外转录RNA
覆盖待测范围
R² > 0.99
Cq值
标准曲线换算
标准曲线的三个关键指标：①扩增效率 E 应在 90%-110% 之间（斜率 -3.6 至 -3.1）；②R² 应大于 0.99；③标准曲线浓度范围应覆盖待测样本的实际浓度。没有标准曲线，Cq 值只是一个相对数值，无法换算成绝对量。
对于病毒感染性疾病，如乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）等，经典酶联免疫吸附法（ELISA）只能对患者血清中各抗原和抗体相对浓度进行定性与半定量分析，对于患者体内病毒是否处于复制期、病毒复制量等情况，无法做出准确的评估与判断。
目前，基于实时荧光定量PCR技术的HBV DNA病毒检测试剂盒（定量范围 10~105 拷贝/mL），已经广泛应用于HBV患者的诊断和治疗中。根据血清标本中HBV的DNA拷贝数绝对量的变化，可以准确判断患者病毒复制能力和传染性强弱，并且可以调整治疗方案。
丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）RNA病毒载量的确定目前也多用实时荧光定量PCR方法进行。不同HCV RNA定量检测法可用拷贝/mL和IU/mL两种表示方法，两者之间进行换算时，应采用不同检测方法的换算公式。HCV载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病毒疗效评估的观察指标。
除乙型和丙型肝炎病毒外，国内外公司或科研机构还对包括人类免疫缺陷病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的序列结构进行比对设计，针对其保守结构设计特异的引物和探针，并经过筛选、验证保证结果的特异性和准确性。
从人血清或血浆中提取乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA），在引物的引导下，以 dNTP 为底物，通过耐热 DNA 聚合酶的酶促作用，对 HBV DNA 进行体外扩增。在体系中采用 TaqMan 探针法并结合竞争性内标技术来定量检测人血清或血浆中 HBV DNA 的数量。
取待测样本血清或血浆各 100 μL，加入到 0.5 mL 离心管中，加入 100 μL DNA 提取液 A 和 5 μL 内标（含有适量的非 HBV 基因片段的非传染性 DNA）振荡混匀，13000 r/min 离心 10 min，吸弃上清；再加入 25 μL DNA 提取液 B，振荡 10 s，100℃ 干浴或沸水浴 10 min，13000 r/min 离心 10 min，保留上清，样本裂解产物保存在 -20℃。
设所需要的管数为 n，n=样本数+1 管阴性对照（HBV DNA 阴性的混合血清）+阳性工作标准品[含有特定浓度的 HBV 基因片段的非传染性 DNA，浓度为 (1~5)×107 拷贝/mL、(1~5)×106 拷贝/mL、(1~5)×105 拷贝/mL、(1~5)×104 拷贝/mL、(1~5)×103 拷贝/mL]。每个 PCR 反应体系的配制如下：HBV PCR 反应液（含有引物、探针和 dNTP）37.7 μL，Taq 酶 0.3 μL，UDG 酶 0.1 μL。上述反应液按照 n 份混匀后，以每管 38 μL 分装至 200 μL PCR 管中，并分别加入阴性对照品、标准品以及提取好的未知样品核酸提取物 2 μL。
PCR 反应程序：37℃ 5 min；94℃ 2 min；95℃ 5 s；60℃ 40 s；并将 95℃ 5 s；60℃ 40 s 程序重复 40 个循环。
首先，设定阈值线，以基线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且拷贝数=0 拷贝/mL 为准（即 Cq 值不出现任何数值）；其次，各标准品的 Cq 值均应≤36，否则实验结果视为无效；最后，以 5 个工作标准品的拷贝浓度的对数值为横坐标，以各自对应的 Cq 值为纵坐标拟合标准曲线，标准曲线的拟合度应小于等于 -0.980，否则视为定量结果无效。未知样品的 Cq 值要落在上述标准曲线定量范围内，如 Cq 值小于 (1~5)×107 拷贝/mL 对应的 Cq 值，应用正常人血清按 10 倍梯度做相应稀释，使其拷贝数落在上述标准曲线定量范围内再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正，获得未知样品的 HBV DNA 含量拷贝数。
临床价值：HBV DNA 定量检测的核心价值在于——ELISA 只能回答"有没有抗体/抗原"，而 qPCR 能回答"病毒复制得有多活跃"。这个绝对拷贝数直接指导临床用药方案的调整和疗效评估。
在新药的研发过程中，对其生物体内的药物代谢与动力学评价是其研究和申报的重要内容之一。随着生物技术药物的迅猛发展，核酸治疗剂在基因治疗中扮演着越来越重要的角色，对其生物安全性、生物分布等研究也是关注的热点之一。
目前常见的核酸治疗剂主要有质粒 DNA 疫苗、CpG 免疫佐剂、DNA 寡核苷酸类药物以及可能成为药物的 microRNA 和 siRNA 类药物。在利用实时定量 PCR 技术对质粒 DNA 进行生物学分布的研究中，由于考虑到样品中＜10 拷贝很难可靠定量以及存在的各种原因造成的 PCR 抑制效应，FDA 的生物制品评估与研究中心（CBER）建议 qPCR 对于质粒 DNA 的可靠定量低限（LLOQ）是 50~100 拷贝/μg gDNA。
在该类研究中，重要的难点之一就是要确保生物基质效应对目标基因的定量检测的影响是一致的，因此，通常需要在不同生物基质中建立标准曲线，再根据标准曲线对相同生物基质中的目标基因拷贝数进行测定。而各生物基质中的标准曲线的建立又需要一个可以归一的指标，经过实验证明，100 ng 的基因组 DNA 较为适合作为这类归一指标。目前该方法已成熟地应用在外源性核酸药物的临床和非临床评价研究中。
pUMVC3-Gag 质粒作为荧光实时 PCR 绝对定量方法中的标准品，稀释成 109 拷贝/μL 作为储存液分装，质粒拷贝数（plasmid copy number, PCN）计算公式：
PCN = (6.02×1023 拷贝/mol) × DNA量(g) / [DNA长度(bp) × 660g/(mol·bp)]
将标准品系列稀释成 107~10 拷贝/μL 作为模板，可以设计不同的引物对及浓度，优化不同的退火温度及时间，最终根据标准曲线制备的斜率和拟合度，确定最优条件。
PCR 反应体系：标准品 1 μL（相当于 107-10 拷贝），2× SYBR Green I PCR mix 10 μL；引物 10 μmol/L 各 0.3 μL，ddH2O 补足 20 μL 体系。
PCR 反应程序：50℃ 2 min；94℃ 10 min；94℃ 30 s；56℃ 30 s；72℃ 30 s；读板收集荧光数据；从第三步骤起重复 38 个循环；熔解曲线分析。
提取小鼠各组织中的基因组 DNA（gDNA），均稀释至 100 ng/μL，在不同组织提取的 gDNA 中进行标准曲线扩增（107-10 拷贝），获得各生物基质中的标准曲线用于定量。阴性对照中以 ddH2O 替代标准品，在无污染且阴性对照 Cq 值大于各标准品产生的 Cq 值时认为结果有效。
PCR 反应体系：标准品 1 μL（相当于 107~10 拷贝），gDNA 1 μL，2× SYBR Green I PCR mix 10 μL；引物 10 μmol/L 各 0.3 μL，ddH2O 补足 20 μL 体系。PCR 反应程序同上。
核酸疫苗免疫小鼠，不同时间点解剖，获取不同的组织，提取 gDNA，均稀释至 100 ng/μL，PCR 反应体系和程序同上。根据各自程序的标准曲线回算各组织中不同时间点情况下质粒的拷贝数，得到该核酸疫苗在小鼠体内的生物分布图。
核心难点：不同组织提取的 gDNA 中可能含有不同的 PCR 抑制物，因此不能"一张标准曲线打天下"。必须在每种生物基质中单独建立标准曲线，才能保证定量结果的准确性。100 ng 基因组 DNA 作为归一化指标，是目前公认的解决方案。
利用基因工程技术改变基因组构成，将优良的外源基因导入植物、动物或者微生物体内，改造其遗传物质，使其性状、营养价值或品质向人类需要的目标转变，是目前研究的热点之一。虽然转基因产品已经获得上市，但是对于转基因产品的安全性问题一直存在诸多争议，因此，对转基因产品需要进行有效的标识管理，并对其中的外源基因含量加以精确定量和限制，均依赖于灵敏准确的基因检测与定量技术。
转基因成分实时荧光定量 PCR 检测水平可分为 4 种：
| 检测水平 | 检测目标 | 特点 |
|---|---|---|
| 通用序列检测 | 调控基因序列（如启动子、终止子等）和抗性标记 | 检测特定转化的靶基因 |
| 基因特异性序列检测 | 插入的外源特异性基因内部的一段序列 | 特异性高于通用序列 |
| 结构特异性序列检测 | 插入载体的外源基因间 2 个元件的连接区域序列 | 可区分部分品系 |
| 品系特异性序列检测 | 外源插入载体与植物基因组连接的边界序列 | 每个品系具有特异连接区，单拷贝，特异性与准确性最高 |
品系特异性序列，即外源插入载体与植物基因组连接的边界序列，由于每一个转基因植物品系都具有这个特异的连接区序列，且该序列为单拷贝，因此，品系特异性检测方法具有较高的特异性和准确性。目前，商品化转基因作物已经陆续建立品系特异性检测方法，如转基因大豆、转基因玉米、转基因马铃薯等。
采用 GMO 基因组 DNA 提取试剂盒提取待测样品中的基因组 DNA，采用紫外分光光度法测定浓度。
对试剂盒中 Bt176 玉米含量分别为 0.1%、0.5%、2.0% 和 5.0% 的标准样品和待测样品进行 cry1Ab 和 Zein 实时荧光 PCR，TaqMan 探针及引物均采用 TaqMan™ PCR Bt176 定量检测试剂盒。
反应体系：20 μL 体系中含 real-time master mix 11.2 μL，模板 DNA 4 μL（约 200 ng）。试剂盒含 4 个浓度标准，同时有内源参照，ddH2O 为模板作为空白对照。
PCR 反应条件：50℃ 2 min；95℃ 10 min；后 40 个循环为 94℃ 15 s；60℃ 1 min。
根据已知标准样品 △Cq 值与转基因含量的对数值（log% GM）得出标准曲线及回归方程，把未知样品 △Cq 值代入回归方程，得到未知样品的转基因含量。
品系特异性检测的核心优势：由于相同的外源表达载体可能以不同拷贝数插入不同植物基因组中，形成性状相同但品系不同的转基因植物，通用序列、基因特异性序列和结构特异性序列检测都无法区分这些品系。只有品系特异性序列（外源插入载体与植物基因组连接的边界序列）是每个品系独有的单拷贝序列，因此具有最高的特异性和准确性。
猜您想看：
- 荧光定量PCR常见问题解析：无Ct值出现？Ct值出现过晚？扩增效率低怎么办。
- SYBR Green I荧光染料法：SYBR Green I 的原理与方法。
- TaqMan荧光探针法：TaqMan 荧光探针法的原理与方法。
- 荧光定量PCR简介：一文读懂荧光定量PCR技术。
- 荧光定量PCR相对定量的应用领域：基因的表达研究、microRNA 定量分析。
- 相对定量与绝对定量的选择：对如何选择相对定量与绝对定量提供一些具体的例子与建议。
- 荧光定量PCR技术服务：高通量荧光定量PCR检测服务。
- 微滴式数字PCR：ddPCR 的原理与应用场景。
相关服务
联系我们
 |
南京栖霞区红枫科技园A6栋2层 |
 |
E-mail：order@zoonbio.com |
 |
技术热线电话: 400-066-8086 |
 |
025-85634800 025-85454800 025-85774800 025-84448440 |