CUT&Tag 的实验流程，可以用一句话概括：把细胞锚在磁珠上，让抗体带着 Tn5 走到靶蛋白旁边，就地切割、就地加接头。与经典 ChIP-seq 不同，CUT&Tag 细胞未用甲醛固定，也不需要进行超声处理——省掉了交联与打断这两大不确定因素，背景更低、分辨率更高、所需细胞量更少。但"步骤少"不等于"随便做"：试剂怎么配、每一步孵育多久、什么时候该终止、PCR 打多少循环，都是决定最终数据质量的关键。本文按试剂配置、八步操作、时间线与排错思路完整展开。
- 流程总览：八步走完 CUT&Tag
- 试剂清单与配制方法
- 一、细胞与磁珠结合
- 二、结合一抗
- 三、pA-Tn5 衔接子转座体
- 四、标签化
- 五、DNA 提取
- 六、PCR 与七、PCR 后处理
- 八、DNA 测序与数据处理
- 常见问题解答（FAQ）
与经典 ChIP-seq 不同，CUT&Tag 细胞未用甲醛固定，也不需要进行超声处理。下面就详细介绍 CUT&Tag 的实验流程，包括细胞与磁珠结合、结合一抗、pA-Tn5 衔接子转座体、标签化、DNA 提取、PCR、高通量测序。
细胞与磁珠结合
ConA 磁珠锚定细胞，室温操作降低细胞压力。
结合一抗
抗体进入细胞核，4℃ 过夜或室温 2 小时。
pA-Tn5 转座体
二抗桥连后，pA-Tn5 被招募到抗体位置。
标签化
37℃ 孵育 1 小时，Tn5 就地切割并加接头。
DNA 提取
EDTA/SDS/蛋白酶 K 终止，PCI 抽提与乙醇沉淀。
PCR
12–14 个循环，插入测序 index。
PCR 后处理
Ampure XP 磁珠纯化与片段筛选。
测序与数据分析
双端测序、比对、峰识别与注释。
| 试剂名称 | 配制方法 | 保存条件 |
|---|---|---|
| 洋地黄皂苷（5%） | 将 50 mg 洋地黄皂苷溶解在 1 mL DMSO 中。 注意：洋地黄皂苷有毒，应特别注意称量粉末。处理任何数量的洋地黄皂苷时，请使用完整的个人防护装备，包括口罩、实验室外套和手套。请注意，DMSO 可以穿透皮肤。 |
按母液保存，现配现用 |
| 结合缓冲液 | 将 400 μL 1M HEPES pH 7.5、200 μL 1M KCl、20 μL 1M CaCl₂ 和 20 μL 1M MnCl₂ 混合，并用 dH₂O 使最终体积达到 20 mL。 | 4℃ 保存 6 个月 |
| 洗涤缓冲液 | 混合 1 mL 1M HEPES pH 7.5、1.5 mL 5M NaCl、12.5 μL 2M 亚精胺，用 dH₂O 使最终体积达到 50 mL，并添加 1 片罗氏完全蛋白酶抑制剂 EDTA 游离片。 | 4℃ 保存最多 1 周 |
| Dig-wash 缓冲液 | 将 400 μL 5% 的 Digitonin 与 40 mL Wash 缓冲液混合。 | 4℃ 保存最多 2 天 |
| 抗体缓冲液 | 将 8 μL 0.5M EDTA 和 6.7 μL 30% BSA 与 2 mL Dig-wash 缓冲液混合，并置于冰上。 | 冰上，现配现用 |
| Dig-300 缓冲液 | 混合 1 mL 1M HEPES pH 7.5、3 mL 5M NaCl 和 12.5 μL 2M 亚精胺，用 dH₂O 使最终体积达到 50 mL，并加入 500 μL 5% Digitonin 和 1 片罗氏完全蛋白酶抑制剂无 EDTA 片剂。 | 4℃ 保存最多 2 天 |
| 标记缓冲液 | 混合 5 mL Dig-300 缓冲液和 50 μL 1M MgCl₂。 | 现配现用，置于冰上 |
| Tn5-衔接子复合物 | ①将 Mosaic 末端-衔接子 A（ME-A）和 Mosaic 末端-衔接子 B（ME-B）寡核苷酸分别与 Mosaic 末端-反向寡核苷酸退火；②将 16 μL 的 100 μM 等摩尔预退火 ME-A 和 ME-B 寡核苷酸混合物与 100 μL 的 5.5 μM 蛋白 A-Tn5 融合蛋白混合；③将混合物在旋转平台上于室温下孵育 1 小时，然后在 -20℃ 下保存。 | -20℃ 保存，避免反复冻融 |
轻轻地重悬并抽出足够的 ConA 珠浆，这样每个最终样品将有 10 μL。
将 170 μL ConA 珠状浆液转移到 2 mL 管中的 1.6 mL 结合缓冲液中，并通过移液进行混合。将试管放在磁力架上进行清理（30 秒至 2 分钟）。
完全取出液体，然后从磁铁架上取下。加入 1.5 mL 结合缓冲液，通过移液混合，从盖子和侧面用微量离心机快速脉冲除去液体。
重悬于 1.7 mL 结合缓冲液（每个样品 100 μL）中并保持，直到细胞被清洗并准备就绪。
关键步骤：细胞透化之前的所有步骤均在室温下进行，以最大程度地降低细胞受到的压力。我们建议避免在重悬和剧烈涡旋过程中出现气穴现象。在室温下收获新鲜的培养物并计数细胞。
在室温下离心 3 分钟，并抽出液体。
在室温下重悬于至少 1 体积的洗涤缓冲液中，在室温下离心 3 分钟，并抽出液体。
重悬于 1.5 mL 洗涤缓冲液中，并转移至 2 mL 管中。轻轻涡旋（1100 rpm）时，滴加珠状浆料。放置在旋转器上 5-10 分钟。
快速旋转以除去盖子上的液体后，将试管放在磁铁架上以清除并取出液体。
将细胞重悬于 800 μL 冰冷抗体缓冲液中，轻轻摇晃，置于冰上，分成 16 个 1.5 mL 试管，每个试管 50 μL。
将每种抗体在 50 μL 抗体缓冲液中混合，并加入样品等分试样，对每个最终样品进行轻柔涡旋。
放在 4℃ 的 nutator 上，在 4℃ 孵育过夜至几天。或者，在室温下拧紧 2 小时。摇动时，液体应留在管子的底部和侧面。
关键步骤：要评估该程序是否成功而无需准备文库，请并行加入阳性对照抗体和可选的阴性对照抗体。
快速旋转以除去盖子上的液体（＜100 xg）后，将每个管子放在磁体支架上以清除并拉出液体。
将二抗 1:100 混合在 Dig-wash 缓冲液中，向每个样品中注入 50 μL，同时轻轻旋转，以使溶液从侧面除去珠子。
将试管放在室温的 nutator 上 30–60 分钟。
快速旋转后，将试管放在磁铁架上以清除并抽出液体。将微珠重悬于 200 μL Dig-wash 缓冲液中。
重复步骤 7。
在 Dig-300 缓冲液中混合 pA-Tn5 衔接子复合物至终浓度为 1:250，每个样品 100 μL。
将试管放在磁体支架上，以清除并除去液体。
加入 100 μL pA-Tn5 混合物，同时轻轻涡旋以使溶液去除大部分或所有珠子。Dig-300 缓冲液（300 mM NaCl）中可能会出现小的团块，但这不会影响孵育或洗涤的效率。
将试管在室温下置于 nutator 上 1 小时。
快速旋转后，将试管放在磁铁架上以清除液体。
加入 800 μL Dig-300 缓冲液。颠倒 10 次或轻轻涡旋以使溶液去除大部分或所有珠子。
重复步骤 5-6 两次。
快速旋转后，将管子放在磁体支架上以清除并拉出液体。
加入 300 μL Tagmentation 缓冲液，同时轻轻涡旋。
在 37℃ 下孵育 1 小时。
要终止标签化反应，在室温下向每个样品中添加 10 μL 0.5M EDTA、3 μL 10% SDS 和 2.5 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K。
在 50℃ 或 37℃ 下孵育 1 小时过夜以进行消化。
添加 300 μL PCI，并通过全速涡旋混合约 2 秒。
转移到锁相管中，在室温下以 16,000 ×g 离心 5 分钟。
加入 300 μL 氯仿，倒置约 10 次进行混合。允许分开。
移液至装有 750 μL 100% 乙醇的新管中，上下移液混合以除去水层。
在冰上冷却并在 4℃ 下离心 15 分钟。
小心地倒出液体并沥干纸巾。通常没有可见的颗粒。
在 1 mL 100% 乙醇中冲洗，并在 4℃ 下以 16,000 ×g 的速度离心 1 分钟。
小心地倒出液体并沥干纸巾。空气干燥。沉淀干燥后，溶于 25-30 μL 1mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.1mM EDTA 中。
六、PCR
通过 PCR 扩增 DNA，以插入高通量测序指标。
关键步骤：为了最大程度地减少大 DNA 片段和过量引物的影响，PCR 循环最好为 12-14 个循环。
文库产量不足，难以满足上机需求；低丰度靶标信号可能被淹没。
在产量与文库质量之间取得平衡，减少大片段与过量引物的影响。
大片段与引物二聚体被过度放大，重复序列比例上升、背景升高。
七、PCR 后处理
管冷却后，从循环仪中取出并添加 1.1 体积（55 μL）的 Ampure XP 珠，并在充满时短暂涡旋。
快速旋转，在室温下静置 10 分钟。
放置在磁铁上并使其清除，然后小心取出液体。在磁铁上且不干扰磁珠的情况下，加入 1 mL 80% 乙醇。
用移液管将液体移至试管底部，然后加入 1 mL 80% 的乙醇。
取出液体并用 20 μL 移液器除去残留的液体，然后干燥 4-5 分钟。
从磁铁架上取下，加入 25 μL 10 mM Tris-HCl（pH 8.0），并充分涡旋。
5 分钟后，将其放在磁铁架上并使其清除。用移液器将液体移至新的试管中。
完成 PCR 后处理之后，文库即可进入二代测序环节。推荐双端测序（2×50 bp、2×100 bp、2×150 bp 均可），数据量按靶蛋白丰度与物种基因组大小在 3~20M reads 区间内确定。下机后进行比对、去重、峰识别与注释，最终得到全基因组范围内的靶蛋白结合位点图谱。
以上就是我们总结的关于 CUT&Tag 的详细实验流程。
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