染色质免疫共沉淀（ChIP）下游检测方法总结

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ChIP 做完了，DNA 拿到了，然后呢？除了做验证实验外，ChIP DNA 也可进行测序分析和芯片分析。测序分析对应的方法是染色质免疫共沉淀测序（ChIP-SEQ）；芯片分析对应的方法是 ChIP-on-chip。这两种方法都可以用于分析目的蛋白结合的未知序列。本文系统总结 ChIP 下游检测的三种方法——qChIP、ChIP-SEQ 和 ChIP-on-chip，并从分辨率、覆盖范围、灵敏度等维度进行对比，帮助你在实验设计阶段就做出明智选择。

📋 本文内容速览
  1. 三种下游检测方法总览
  2. 方法一：实时定量PCR（qChIP）
  3. 方法二：染色质免疫共沉淀测序（ChIP-SEQ）
  4. 方法三：ChIP-on-chip（全基因组定位分析）
  5. ChIP-SEQ 与 ChIP-on-chip 的对比
  6. 方法选择决策指南
  7. 常见问题解答（FAQ）
PART 01三种下游检测方法总览

ChIP 实验完成后，得到的 DNA 样品需要通过下游检测方法进行分析。根据实验目的的不同，可以选择 qChIP、ChIP-SEQ 或 ChIP-on-chip 三种方法。

📊
qChIP
实时定量PCR检测沉淀的DNA样品
在体内确定DNA和蛋白质相互作用
验证已知位点
🧬
ChIP-SEQ
直接测序确定ChIP DNA序列
全基因组范围发现结合位点
全基因组发现
🔬
ChIP-on-chip
ChIP与DNA微阵列芯片结合
全基因组定位分析（GWLS）
高通量分析
图1 ChIP 下游检测的三种方法总览
核心区别：qChIP 回答"这个已知位点是否被结合"；ChIP-SEQ 回答"全基因组范围内这个蛋白结合了哪些位点"；ChIP-on-chip 回答"在芯片覆盖的区域内这个蛋白结合了哪些位点"。三者的通量、分辨率和成本依次递增。
PART 02方法一：实时定量PCR（qChIP）

用比较精确的实时定量PCR方法检测沉淀的DNA样品，称为实时定量染色质免疫共沉淀技术（qChIP）。

这种方法是在体内确定DNA和蛋白质相互作用。与ChIP-on-chip方法相比，成本低廉。目前实时定量染色质免疫共沉淀技术（qChIP）已经开始应用于分析减数分裂时期蛋白质和DNA相互作用的研究。

qChIP 适用场景：① 已知目标蛋白的结合位点，只需验证；② 需要快速、低成本地检测多个候选位点；③ 实验室不具备高通量测序或芯片平台；④ 作为 ChIP-SEQ 或 ChIP-on-chip 的前期验证。
qChIP 实验要点：① 引物设计——扩增片段建议200-400 bp，跨越目标结合位点；② 对照设置——必须设置Input对照、IgG阴性对照和空白对照；③ 数据分析——用2^-ΔΔCt法或百分比Input法计算富集倍数；④ 结果判读——相对于IgG对照的5倍富集通常视为阳性。
PART 03方法二：染色质免疫共沉淀测序（ChIP-SEQ）

为了在基因组范围内重新发现转录因子的结合位点，需进一步确定染色质免疫共沉淀实验得到的DNA样品的序列。其序列可以通过直接测序确定，这种方法称为染色质免疫共沉淀测序（ChIP-SEQ）。

ChIP-SEQ 为巨大的DNA并行序列应用快速进化平台，以高分辨率确定样品中富集的基因组区域。目前，Illumina Genome Analyzer（GA）技术频繁用于染色质免疫共沉淀测序（ChIP-SEQ）应用的平台。其它针对高通量测序的平台是 Helicos HeliScope 和 ABI SOL-iD。

染色质免疫共沉淀
图2 ChIP-SEQ 技术流程示意
1ChIP反应

完成 ChIP 实验，获得富集的 DNA 样品。

2文库构建

对 ChIP DNA 进行末端修复、加 A、接头连接、PCR 扩增等步骤，构建测序文库。

3高通量测序

在 Illumina GA、Helicos HeliScope 或 ABI SOL-iD 等平台上进行测序。

4生物信息学分析

将测序reads比对到参考基因组，识别富集区域（peaks），进行峰注释和功能分析。

ChIP-SEQ 的核心优势：① 分辨率高——理论上可达单核苷酸分辨率；② 覆盖全——可覆盖全基因组，不受芯片设计限制；③ 灵敏度高——可检测低丰度结合位点；④ 数据量大——可发现新的结合位点和调控机制。这也是 ChIP-SEQ 逐渐取代 ChIP-on-chip 成为主流方法的原因。
PART 04方法三：ChIP-on-chip（全基因组定位分析）

ChIP-on-chip 是将染色质免疫共沉淀（ChIP）和DNA微阵列芯片技术相结合用来高通量分析DNA和蛋白质结合或者翻译后染色质/组蛋白修饰的一种方法。该技术已经成为深入研究内源蛋白和DNA相互作用的有力工具。因该技术能在基因组范围内确定转录因子或组蛋白修饰所在位置的染色质结合位点，故也被称为全基因组定位分析（genome-wide location analysis，GWLS）。

该技术是将染色质免疫共沉淀与包含整个基因组或特定目的区域的芯片联合使用，大规模地迅速确定生理条件下特定转录因子在染色体上的结合位点。

具体方法：

1ChIP DNA 扩增与标记

将经过染色质免疫共沉淀的DNA样品纯化后进行PCR扩增，然后用荧光素标记（如 Cy3）。

2Input DNA 标记

对没有经过免疫沉淀反应富集的 Input DNA 样品也进行扩增，并且用另一种荧光素标记（如 Cy5），作为结合背景的参照。

3芯片杂交

将这两种 DNA 杂交于包括基因组序列的微阵列芯片上，转录因子结合的靶序列用每个点相应的荧光强度来确定。

关键影响因素：样品准备是影响 ChIP-on-chip 结果的一个重要因素。目前常用的是覆瓦式芯片（tiling arrays），该芯片包含完全非重复性基因组。由于 ChIP-on-chip 实验数据量大，问题复杂，所以下游的生物信息学分析相当重要。
生物信息学工具推荐：Toedling 等人应用免费和公开的资源 R package Ringo，使 ChIP-on-chip 实验数据的分析更便利。这个软件能提供循环数据输入功能，质量评价，标准化和形象化数据，检测ChIP富集的基因组区域。

ChIP-on-chip 扩展了染色质免疫共沉淀(ChIP)技术的应用范围，可以用于基因组功能的研究，能够绘制基因顺式调控区域和核小体位置及修饰的细节，完善真核生物的序列。这种方法首次应用在酿酒酵母的研究上，之后被应用于人细胞的研究。在医学方面，已经应用"ChIP-on-chip"技术确定了骨细胞的动态转录机制。总之，ChIP-on-chip 已经成为一种在基因组范围内研究蛋白质和DNA相互作用及转录调控机制的常用方法。随着各个物种基因组覆瓦式芯片陆续发布，全基因组定位分析技术的应用将会越来越广泛。

PART 05ChIP-SEQ 与 ChIP-on-chip 的对比

染色质免疫共沉淀测序（ChIP-SEQ）和 ChIP-on-chip 是两类在基因组范围内产生DNA结合图谱的基本方法。ChIP-SEQ 和 ChIP-on-chip 的主要区别是分辨率、覆盖范围和灵敏度。

ChIP-SEQ
单核苷酸分辨率
高分辨率、覆盖全、灵敏度高
ChIP-on-chip
受覆瓦度限制
分辨率受芯片设计限制
图3 ChIP-SEQ 与 ChIP-on-chip 的分辨率对比
🧬 ChIP-SEQ
  • 分辨率：理论上可达单核苷酸
  • 覆盖范围：全基因组，不受设计限制
  • 灵敏度：高，可检测低丰度位点
  • 数据量：大，需专业生信分析
  • 成本：较高
🔬 ChIP-on-chip
  • 分辨率：受覆瓦（tiling）度限制
  • 覆盖范围：受芯片设计限制
  • 灵敏度：相对较低
  • 数据量：相对较小
  • 成本：中等
对比维度 ChIP-SEQ ChIP-on-chip qChIP
分辨率 单核苷酸分辨率 受覆瓦度限制 取决于引物扩增片段
覆盖范围 全基因组 芯片覆盖区域 已知位点
灵敏度 高 中等 中等
通量 高 高 低
成本 较高 中等 低
数据分析 需专业生信 需专业生信 常规qPCR分析
适用场景 全基因组发现 特定区域分析 已知位点验证
联合使用策略：如果将以上两种方法结合，ChIP-on-chip 可作为在基因组范围内评价转录因子结合位点的第1步，来粗略估计结合位点的数目和富集的总体值；然后通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-SEQ），以更好的分辨率深入描述结合位点。目前，已经用 ChIP-SEQ 和 ChIP-on-chip 确定了拟南芥花调控因子 SEPALLATA3（SEP3）的结合位点。
PART 06方法选择决策指南
实验目的 推荐方法 理由
验证已知蛋白是否结合已知DNA位点 qChIP 成本低、周期短、操作简单
全基因组范围内发现蛋白结合位点 ChIP-SEQ 分辨率高、覆盖全、灵敏度高
聚焦特定区域或已有芯片平台 ChIP-on-chip 芯片覆盖区域明确，数据分析相对成熟
先粗筛再精细定位 ChIP-on-chip + ChIP-SEQ 先粗略估计，再高分辨率深入描述
拟南芥花调控因子结合位点研究 ChIP-SEQ 或 ChIP-on-chip 已成功应用于 SEP3 结合位点鉴定
趋势展望：随着高通量测序成本的持续下降和生物信息学工具的日益成熟，ChIP-SEQ 正逐步取代 ChIP-on-chip 成为 ChIP 下游检测的主流方法。但对于已有芯片平台或特定区域研究需求，ChIP-on-chip 仍有其应用价值。
PART 07常见问题解答（FAQ）
ChIP下游检测方法主要有哪几种？
ChIP下游检测方法主要有三种：①实时定量PCR（qChIP）——用比较精确的实时定量PCR方法检测沉淀的DNA样品，适合验证已知结合位点；②染色质免疫共沉淀测序（ChIP-SEQ）——通过直接测序确定ChIP DNA样品的序列，可在基因组范围内重新发现转录因子的结合位点；③ChIP-on-chip——将ChIP和DNA微阵列芯片技术相结合，用于高通量分析DNA和蛋白质结合或翻译后染色质/组蛋白修饰。
qChIP方法有什么优缺点？
qChIP（实时定量染色质免疫共沉淀技术）是在体内确定DNA和蛋白质相互作用的方法。与ChIP-on-chip方法相比，成本低廉。目前qChIP已经开始应用于分析减数分裂时期蛋白质和DNA相互作用的研究。缺点是通量低，只能检测已知的有限位点，无法发现新的结合位点。
ChIP-SEQ的原理和常用平台是什么？
为了在基因组范围内重新发现转录因子的结合位点，需进一步确定ChIP实验得到的DNA样品的序列。其序列可以通过直接测序确定，这种方法称为染色质免疫共沉淀测序（ChIP-SEQ）。ChIP-SEQ为巨大的DNA并行序列应用快速进化平台，以高分辨率确定样品中富集的基因组区域。目前，Illumina Genome Analyzer（GA）技术频繁用于ChIP-SEQ应用的平台。其它针对高通量测序的平台是Helicos HeliScope和ABI SOL-iD。
ChIP-on-chip的原理是什么？
ChIP-on-chip是将染色质免疫共沉淀（ChIP）和DNA微阵列芯片技术相结合用来高通量分析DNA和蛋白质结合或者翻译后染色质/组蛋白修饰的一种方法。该技术已经成为深入研究内源蛋白和DNA相互作用的有力工具。因该技术能在基因组范围内确定转录因子或组蛋白修饰所在位置的染色质结合位点，故也被称为全基因组定位分析（genome-wide location analysis，GWLS）。具体方法是将ChIP DNA样品纯化后进行PCR扩增，用荧光素标记（如Cy3）；Input DNA样品也进行扩增，用另一种荧光素标记（如Cy5）作为参照；之后将两种DNA杂交于微阵列芯片上，转录因子结合的靶序列用每个点相应的荧光强度来确定。
ChIP-SEQ和ChIP-on-chip有什么区别？
ChIP-SEQ和ChIP-on-chip是两类在基因组范围内产生DNA结合图谱的基本方法。主要区别是分辨率、覆盖范围和灵敏度：①分辨率——测序技术理论上需要单核苷酸分辨率，而芯片技术受到覆瓦（tiling）度的限制；②覆盖范围——ChIP-SEQ可覆盖全基因组，ChIP-on-chip覆盖范围受芯片设计限制；③灵敏度——ChIP-SEQ通常灵敏度更高。如果将两种方法结合，ChIP-on-chip可作为在基因组范围内评价转录因子结合位点的第一步，粗略估计结合位点的数目和富集的总体值；然后通过ChIP-SEQ，以更好的分辨率深入描述结合位点。
如何选择ChIP下游检测方法？
选择依据是实验目的：①如果已知目标蛋白的结合位点，只需验证——选择qChIP，成本低、周期短；②如果目标蛋白的结合位点未知，需要全基因组范围内的发现——选择ChIP-SEQ，分辨率高、覆盖全；③如果需要聚焦特定区域或已有芯片平台——选择ChIP-on-chip；④如果希望先粗略估计再精细定位——可先用ChIP-on-chip做初步筛选，再用ChIP-SEQ深入描述。

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