ADA 单克隆抗体，是抗体药物免疫原性评价中的"标准品"。与多克隆抗体相比，单克隆抗体批次间一致性更好、可长期稳定供应，更适合需要标准化检测方法的场景。本文介绍 ADA 单克隆抗体的制备方案，分两个阶段：第一阶段完成动物免疫与筛选方法的建立与验证，第二阶段完成 ADA 杂交瘤细胞制备，涵盖电融合、ELISA 筛选、有限稀释法单克隆化与无血清扩增培养。
📋 本文内容速览
- 方案概述：两阶段制备逻辑
- 项目进度与里程碑
- 阶段一（M1）：动物免疫与筛选方法的建立与验证
- 阶段二（M2）：ADA 杂交瘤细胞制备
- 细胞株选择漏斗与质控指标
- 交付内容
- 常见问题解答（FAQ）
PART 01方案概述：两阶段制备逻辑
本方案将 ADA 单克隆抗体的制备分为两个阶段：阶段一（M1）完成动物免疫与筛选方法的建立与验证，阶段二（M2）完成 ADA 杂交瘤细胞制备。两阶段之间设置 GO/NO-go 决策点，确保进入下一阶段的原料质量可靠。
两阶段的核心逻辑：阶段一解决"能不能免疫出高效价抗血清"的问题——通过 F(ab')2 免疫和 ELISA 效价评估，确认免疫系统是否产生了针对目标抗体的强烈应答。阶段二解决"能不能筛选出高特异性单克隆细胞株"的问题——通过电融合、ELISA 双色筛选、有限稀释法单克隆化，获得针对 CDR 区的单克隆细胞株。
单抗 vs 多抗的核心区别：ADA 多克隆抗体通过抗原亲和纯化从抗血清中获得，周期约 1-2 周，但批次间存在差异；ADA 单克隆抗体需要经过细胞融合、筛选、单克隆化和扩增培养，周期约 3-4 个月，但一旦获得稳定的杂交瘤细胞株，就可以长期、一致地生产抗体。两者的第一阶段（动物免疫）流程相似，区别主要在第二阶段。
PART 02项目进度与里程碑
第1-2月
第3-4月
第5-6月
第7月
M1 动物免疫
与效价评估
与效价评估
GO/NO-go
决策点
决策点
M2 杂交瘤
制备与筛选
制备与筛选
▲ 项目进度示意：M1 与 M2 之间设置效价达标决策点，两阶段合计约 5-7 个月
| 里程碑 | 关键节点 | 决策标准 |
|---|---|---|
| M1 中期 | 完成 4 次免疫、血清收集 | ELISA 效价初步评估 |
| M1 结束 | 三物种血清效价数据 | 效价达标 → GO，进入 M2 |
| M2 融合 | 电融合、铺 20-30 块 96 孔板 | 获得足够数量的杂交瘤克隆 |
| M2 筛选 | ELISA 双色筛选阳性克隆 | F(ab')2 强阳性 + 同型对照阴性 |
| M2 单克隆化 | 有限稀释法获得 20-30 株细胞株 | 单克隆细胞株上清效价达标 |
| M2 结束 | 最终确定 2-5 株，扩增冻存 | 纯度＞95%、效价＞10 万倍、交叉反应＜2% |
PART 03阶段一（M1）：动物免疫与筛选方法的建立与验证
1目标
完成动物免疫；建立可行的筛选方法；完成鼠血清效价评估，做出 GO/NO-go 决定。
2材料准备
由钟鼎生物进行酶切纯化制备 F(ab')2。
3内容
动物免疫：10 只 Balb/c 小鼠、10 只 SJL 小鼠、6 只 SD 大鼠分别免疫 4 次；ELISA 测定血清效价评估；免疫后血清效价间接 ELISA 检测。
4周期
2-3 个月。
5交付内容
M1 阶段性报告包含免疫流程、血清效价检测数据。
为什么同时使用三种动物：Balb/c 小鼠是最常用的单抗制备宿主，SJL 小鼠对某些抗原的免疫应答可能更强，SD 大鼠则适合需要较大体积血清或对小鼠免疫原性不佳的抗原。多物种并行免疫，可以在 M1 阶段筛选出效价最高、特异性最好的动物，为后续杂交瘤制备提供最佳原料。
PART 04阶段二（M2）：ADA 杂交瘤细胞制备
1目标
通过细胞融合及筛选 ADA 杂交瘤细胞。
2客户提供
同型对照 IgG。
3内容
（1）利用电融合技术将动物脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合并铺 20-30 块 96 孔培养板（融合 2 次）；（2）间接 ELISA 筛选与 F(ab')2 强阳性与同型对照抗体 IgG 不反应的细胞克隆；（3）扩增、复制所有阳性克隆，收集阳性上清提供给客户检测；（4）根据中结果确定阳性细胞株并通过有限稀释法进行单克隆化；（5）获得 20-30 株阳性单克隆细胞株，提供上清给客户进行测试；（6）根据结果最终确定所需细胞株 2-5 株，扩增、冻存；（7）选择 1-2 株细胞株进行无血清扩增培养，收集细胞上清，利用蛋白 A 纯化柱获得纯化抗体。
4技术要求
抗体纯度＞95%；抗体效价＞10 万倍稀释度；特异性识别 CDR 区；与亲本同型对照 IgG 交叉反应＜2%。
5时程
3-4 个月。
6交付内容
M2 报告；纯化单克隆抗体；抗体发货 COA 文件。
与 F(ab')2 反应
++
++
+
++
−
+
++
−
与同型对照 IgG 反应
−
−
+
−
−
+
−
−
筛选结论
✓
✓
✗
✓
✗
✗
✓
✗
双阳性，入选
单阳性
交叉反应，排除
阴性
▲ ELISA 双色筛选示意：只有与 F(ab')2 强阳性且与同型对照 IgG 阴性的克隆（绿色 ✓）才入选
为什么要双色筛选：抗血清中除了针对 CDR 区的特异性抗体，还含有针对抗体恒定区（Fc 段及框架区）的抗体。只检测 F(ab')2 阳性，可能筛到的是针对恒定区的非特异性克隆。只有同时对 F(ab')2 强阳性且对同型对照 IgG 阴性的克隆，才是真正针对 CDR 区的特异性克隆。
电融合 vs PEG 化学融合：电融合技术通过电场诱导细胞膜融合，相比传统 PEG 化学融合，融合效率更高、对细胞毒性更小、重复性更好。对于 ADA 杂交瘤制备这类对融合效率要求较高的项目，电融合可以在相同数量的脾细胞下获得更多杂交瘤克隆，提高筛选到目标细胞株的概率。
PART 05细胞株选择漏斗与质控指标
融合后铺 20-30 块 96 孔板（约 2000-3000 孔）
▼
ELISA 双色筛选：F(ab')2 强阳性 + 同型对照 IgG 阴性
▼
获得 20-30 株阳性单克隆细胞株
▼
最终确定 2-5 株，1-2 株用于生产
▲ 细胞株选择漏斗示意：从数千个杂交瘤克隆逐步筛选到最终用于生产的细胞株
为什么最终只保留 2-5 株，再从中选择 1-2 株生产：M2 阶段先获得 20-30 株阳性单克隆细胞株，经客户测试后最终确定 2-5 株作为储备。从 2-5 株中再选择 1-2 株进行无血清扩增培养和蛋白 A 纯化，是为了在保证抗体质量的前提下控制成本——保留多株储备可以应对后续细胞株稳定性下降或生产需求变化的风险。
| 质控指标 | 技术要求 | 检测方法 |
|---|---|---|
| 抗体纯度 | ＞95% | SDS-PAGE 分析 |
| 抗体效价 | ＞10 万倍稀释度 | 间接 ELISA |
| CDR 区特异性 | 特异性识别 CDR 区 | ELISA 双色筛选 |
| 交叉反应 | 与亲本同型对照 IgG ＜2% | 间接 ELISA |
单抗纯度要求为什么比多抗更高：ADA 单克隆抗体的纯度要求为＞95%，而 ADA 多克隆抗体为＞90%。这是因为杂交瘤细胞株经过单克隆化筛选，背景更干净；同时单抗通常用于需要长期稳定供应的标准化检测方法，对纯度的要求也更严格。
PART 06交付内容
M1 阶段性交付
- 免疫流程——Balb/c 小鼠、SJL 小鼠、SD 大鼠各免疫 4 次记录
- 血清效价检测数据——间接 ELISA 效价结果
- GO/NO-go 评估——是否进入 M2 的决策依据
M2 阶段性交付
- M2 报告——融合、筛选、单克隆化完整记录
- 纯化单克隆抗体——纯度＞95%，效价＞10 万倍
- 细胞株冻存——2-5 株阳性单克隆细胞株
- COA 文件——随抗体发货提供
COA 文件的作用：COA（Certificate of Analysis，分析证书）是抗体质量的正式证明文件，包含纯度、浓度、效价、交叉反应等关键质控数据。对于 ADA 检测方法的建立和验证，COA 是方法学验证的重要支持材料。
PART 07常见问题解答（FAQ）
ADA单克隆抗体制备与ADA多克隆抗体制备有什么区别？
两者的主要区别在于第二阶段：ADA多克隆抗体制备通过抗原亲和纯化从抗血清中获得抗体，周期约1-2周；ADA单克隆抗体制备则需要进行细胞融合、ELISA筛选、有限稀释法单克隆化和无血清扩增培养，周期约3-4个月，但可以获得批次间高度一致、可长期稳定供应的单克隆细胞株。两者第一阶段（动物免疫与筛选方法建立）流程相似。
为什么阶段一同时使用Balb/c小鼠、SJL小鼠和SD大鼠？
同时使用三种动物进行免疫，是为了提高获得高特异性抗CDR区抗体的概率。不同物种的免疫系统对同一抗原的应答存在差异——有的动物可能对CDR区产生更强的特异性应答，有的可能对恒定区产生更多非特异性抗体。通过多物种免疫，可以在M1阶段筛选出效价最高、特异性最好的动物，为后续杂交瘤制备提供最佳原料。
为什么M2使用电融合技术而不是PEG化学融合？
电融合技术通过电场诱导细胞膜融合，相比传统的PEG化学融合，融合效率更高、对细胞的毒性更小、重复性更好。对于ADA杂交瘤制备这类对融合效率要求较高的项目，电融合可以在相同数量的脾细胞下获得更多的杂交瘤克隆，提高筛选到目标细胞株的概率。
M2阶段为什么要铺20-30块96孔板并进行2次融合？
铺20-30块96孔板（每板96孔，共约2000-3000个孔）进行2次融合，是为了保证足够的杂交瘤克隆数量。融合效率通常较低，只有部分融合细胞能形成可分泌抗体的杂交瘤。通过大规模铺板和重复融合，可以显著提高筛选到高特异性、高效价ADA单克隆细胞株的概率。
ELISA筛选时为什么要同时检测F(ab')2强阳性和同型对照IgG阴性？
ELISA筛选采用双色筛选策略：①与F(ab')2强阳性——确认杂交瘤分泌的抗体能识别目标抗体片段；②与同型对照IgG不反应——确认抗体不是针对抗体恒定区（Fc段及框架区）的非特异性抗体。只有同时对F(ab')2强阳性且对同型对照IgG阴性的克隆，才是真正针对CDR区的特异性克隆。
为什么最终只保留2-5株细胞株，再从中选择1-2株进行生产？
M2阶段先获得20-30株阳性单克隆细胞株，经客户测试后最终确定2-5株作为储备。从2-5株中再选择1-2株进行无血清扩增培养和蛋白A纯化，是为了在保证抗体质量的前提下控制成本——保留多株储备可以应对后续细胞株稳定性下降或生产需求变化的风险，而实际生产只需要1-2株即可满足供应。
ADA单克隆抗体的质控指标有哪些？
ADA单克隆抗体的质控指标包括：①抗体纯度＞95%（SDS-PAGE分析）；②抗体效价＞10万倍稀释度；③特异性识别CDR区；④与亲本同型对照IgG交叉反应＜2%。相比ADA多克隆抗体（纯度＞90%），单克隆抗体的纯度要求更高，因为杂交瘤细胞株经过单克隆化筛选，背景更干净。
两个阶段的周期分别是多久？
阶段一（M1）的周期为2-3个月，包括Balb/c小鼠、SJL小鼠和SD大鼠的免疫与血清效价评估。阶段二（M2）的周期为3-4个月，包括细胞融合、ELISA筛选、阳性克隆扩增、有限稀释法单克隆化、细胞株冻存和无血清扩增培养。两阶段合计约5-7个月。
ADA单克隆抗体可以用于哪些下游应用？
ADA单克隆抗体主要用于：①ADA检测方法的阳性对照；②抗体药物免疫原性评价；③药代动力学检测中的抗药抗体干扰评估；④ADC类药物抗独特型抗体开发；⑤双抗类药物抗独特型抗体开发。相比多克隆抗体，单克隆抗体批次间一致性更好，更适合需要长期稳定供应的检测方法。
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