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传统的酵母双杂交只能检测发生在核内的蛋白相互作用,无法检测胞膜蛋白质间相互作用,钟鼎生物基于酵母分裂泛素化蛋白互作检测系统(Mating Based Split-ubiquitin Assay, mbSUS)特推出膜体系酵母双杂交文库构建,突破传统酵母双杂交技术的局限,欢迎咨询。



膜体系酵母双杂交原理

泛素,是一个由76个氨基酸残基组成的蛋白,可以介导蛋白酶体对目标蛋白质的泛素化降解,在膜系统酵母双杂交体系中,将泛素拆分为两个结构域,即C端的Cub和N端的NbuG,分别与诱饵蛋白Bait和猎物蛋白Prey进行融合表达,同时 Cub还融合表达了转录因子,如果Bait和Prey蛋白能结合,就会带动Cub和NbuG在空间上靠近。形成完整的泛素,进而被蛋白酶体所识别,融合表达的转录因子被切割下来,并进入细胞核内,启动报告基因的表达,最终通过酵母生长与否,即可判断Bait和Prey蛋白之间是否存在相互作用.


膜体系酵母双杂交原理


视频讲解



膜体系载体选择

膜体系酵母双杂选择载体是根据诱饵蛋白质定位的不同来选择,有利于互作蛋白相连的泛素NubG和Cub相互作用,被UBPs识别,从而启动下游报告基因表达。根据下图,我们直观的了解一下不同情况下适合使用的载体。

膜体系载体选择

建库服务大纲

膜体系Gateway建库服务(28S:18S是示例)
实验阶段质控标准周期(工作日)
Total RNA抽提300-500ug,28S:18S=2:1,0D260:280 (1.9-2.1)0D260:230(1.9-2.1)3-5
mRNA富集mRNA电泳条带是弥散且主带分布在 1Kb-2Kb,mRNA总量>4ug1-2
反转录一链二链合成二链呈弥散状均与分布,二链纯化后总量>4ug1-2
加三框接头胶回收胶回收后纯化总量>300ng1-2
膜体系初级重组+电转+ 膜体系初级文库抽提+测序及分析插入片段大小平均>1Kb、鉴定阳性率>90%、 库容>1.0*107、文库质粒>200ug5-7
膜体系次级重组+电转+ 膜体系次级文库抽提+测序及分析插入片段大小平均>1Kb、鉴定阳性率>90%、 库容>1.0*107、文库质粒>200ug5-7
膜体系Gateway建库服务样品标准
样本类型总量完整度/新鲜度0D260:2800D260:230运输/储存
Total RNA300-500ug28S:18S=2:11.9-2.11.9-2.1干冰/-80℃
拟南芥>4g新鲜冻存干冰/-80℃
动物组织>1g新鲜冻存干冰/-80℃
细胞>1.0*108去除培养液加上裂解液/新鲜冻存干冰/-80℃
种子>8g新鲜冻存干冰/-80℃
烟草>4g新鲜冻存干冰/-80℃
根茎>8g新鲜冻存干冰/-80℃
水稻叶片>4g新鲜冻存干冰/-80℃

筛库服务大纲

膜体系双杂筛库
实验阶段质控标准周期(工作日)
诱饵质粒的合成及扩增诱饵质粒15-20
自激活检测及毒性检测+功能验证自激活检测图片+功能验证图片5-7
自激活抑制(如没有自激活,跳过这个步骤自激活抑制图片(45mM3-AT浓度不能抑制实验结束)5-7
初筛初筛图片5-7
复筛复筛图片2-4
阳性克隆测序测序及分析结果+阳性克隆菌液2-4
一对一验证(点对点)验证图片+验证的AD质粒5-7
点板验证验证图片3-4
项目结束项目报告1-2
功能验证通过证明该诱饵适用于膜体系双杂筛库系统,功能验证没有通过实验结束。

案例展示

1. 诱饵验证

为避免因序列差异造成对后期实验结果的影响,需要对客户提供的原始克隆pBT3-N-xxxx进行测序和比对分析。

结论1:诱饵克隆xxxx序列正确,可继续进行后续实验。

2. xxxx诱饵基因毒性、自激活检测和功能验证

(1)pBT3-N-xxxx毒性检测结果:

pBT3-N-xxxx毒性检测结果

结论2:Bait质粒pBT3-N-xxxx转入NMY51后,菌落生长情况同pBT3-N空载转化酵母后的一致,表明Bait质粒对酵母细胞无毒性。

(2)阳性对照:

阳性对照结果

(3)阴性对照:

阴性对照结果

(4)自激活检测结果:

自激活检测结果

结论3:pTSU2-APP Control Vector和pNub G-Fe65 Control Vector于DDO、TDO、QDO培养基中都有克隆生长,阳性对照实验成功。pTSU2-APP Control Vector和pPR3-N Control Vector于DDO培养基上生长但在TDO和QDO培养基上无克隆生长,阴性对照实验成功。BD基因pBT3-N-xxxx+ pPR3-N在DDO上生长,说明pBT3-N-xxxx质粒成功转入酵母菌株中,在TDO有轻微生长QDO培养基上不生长,说明pBT3-N-xxxx在NMY51酵母菌株中有轻微激活活性,可以进行后续筛选。

(5)功能验证结果:

功能验证结果

结论4:将pOST1-NubI和pBT3-N-xxxx质粒共转化NMY51,涂布平板DDO、TDO和QDO,结果DDO有菌落生长,说明共转化成功;涂布平板TDO和QDO均有菌落生长,说明bait质粒能够适应ubiquitin系统,功能验证通过,可以进行下一步验证实验。



3. 文库筛选

(1)初筛:

初筛结果

结论5:初筛结果统计,使用TDO平板进行筛选,初筛筛选到48个克隆。

4. 二次筛选

为了去除假阳性将初筛平板上的克隆,将初筛平板上生长的48个克隆,全部点到QDO/X-gal平板。

二次筛选结果

结论6:复筛由图得知:二次筛选后的克隆均变蓝,所以得到48个阳性克隆。

5. 阳性克隆鉴定

将二次筛选平板上生长显蓝斑的48个阳性克隆进行菌落PCR测序,得到26个测序结果见附件二,进行NCBI比对的分析结果见附件三。

6. 第六部分阳性分离和质粒提取

7. 回转验证(部分图片)

回转验证

结论7:本次筛选初筛筛选到48个克隆,经过二次筛选得到29个阳性克隆,将29个阳性克隆全部分离AD质粒进行回转验证,其中3号克隆活化失败,取消实验,其余28个质粒提取成功。28个质粒测序结果分析后发现6号、30号与阳性克隆测序结果不一致,以质粒测序结果为准。去除重复本次筛选共得到26个阳性基因。

8. 点板验证

挑取感兴趣的蛋白在DDO和QDO/A/X平板上进行稀释点板,(可依据文章需求,进行个性化展示)结果如下:

点板验证

结论8:点板验证和回转验证结果一致。。


部分客户发表文章

1、OsSHI1 Regulates Plant Architecture Through Modulating the Transcriptional Activity of IPA1 in Rice.The Plant Cell.DOI: 10.1105/tpc.19.00023(IF=9.6)

2、ERECTA1 Acts Upstream of the OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK6 Cascade to Control Spikelet Number by Regulating.The Plant Cell.DOI: 10.1105/tpc.17.00959(IF=9.6)

3、CsMYB60 directly and indirectly activates structural genes to promote the biosynthesis of flavonols and proanthocyanidins in cucumber.Hortic Res. doi: 10.1038/s41438-020-0327-z.(IF=5.4)

4、A Novel NAC Transcription Factor,PbeNAC1, of Pyrus betuifoliaConfers Cold and Drought Tolerancevia Interacting with PbeDREBs andActivating the Expression ofStress-Responsive Genes.Frontiers.DOI: 10.3389/fpls.2017.01049.(IF=4.6)



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