传统的酵母双杂交只能检测发生在核内的蛋白相互作用，无法检测胞膜蛋白质间相互作用，钟鼎生物基于酵母分裂泛素化蛋白互作检测系统（Mating Based Split-ubiquitin Assay, mbSUS）特推出膜体系酵母双杂交文库构建，突破传统酵母双杂交技术的局限，欢迎咨询。
膜体系酵母双杂交原理
泛素,是一个由76个氨基酸残基组成的蛋白，可以介导蛋白酶体对目标蛋白质的泛素化降解,在膜系统酵母双杂交体系中，将泛素拆分为两个结构域，即C端的Cub和N端的NbuG,分别与诱饵蛋白Bait和猎物蛋白Prey进行融合表达，同时 Cub还融合表达了转录因子,如果Bait和Prey蛋白能结合，就会带动Cub和NbuG在空间上靠近。形成完整的泛素，进而被蛋白酶体所识别，融合表达的转录因子被切割下来，并进入细胞核内,启动报告基因的表达,最终通过酵母生长与否，即可判断Bait和Prey蛋白之间是否存在相互作用.
视频讲解
膜体系载体选择
膜体系酵母双杂选择载体是根据诱饵蛋白质定位的不同来选择，有利于互作蛋白相连的泛素NubG和Cub相互作用，被UBPs识别，从而启动下游报告基因表达。根据下图，我们直观的了解一下不同情况下适合使用的载体。
建库服务大纲
| 膜体系Gateway建库服务（28S:18S是示例) | |||
|---|---|---|---|
| 实验阶段 | 质控标准 | 周期（工作日） | |
| Total RNA抽提 | 300-500ug，28S：18S=2:1，0D260：280 （1.9-2.1）0D260：230（1.9-2.1） | 3-5 | |
| mRNA富集 | mRNA电泳条带是弥散且主带分布在 1Kb-2Kb,mRNA总量>4ug | 1-2 | |
| 反转录一链二链合成 | 二链呈弥散状均与分布，二链纯化后总量>4ug | 1-2 | |
| 加三框接头胶回收 | 胶回收后纯化总量>300ng | 1-2 | |
| 膜体系初级重组+电转+ 膜体系初级文库抽提+测序及分析 | 插入片段大小平均>1Kb、鉴定阳性率>90%、 库容>1.0*107、文库质粒>200ug | 5-7 | |
| 膜体系次级重组+电转+ 膜体系次级文库抽提+测序及分析 | 插入片段大小平均>1Kb、鉴定阳性率>90%、 库容>1.0*107、文库质粒>200ug | 5-7 | |
| 膜体系Gateway建库服务样品标准 | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| 样本类型 | 总量 | 完整度/新鲜度 | 0D260:280 | 0D260:230 | 运输/储存 |
| Total RNA | 300-500ug | 28S：18S=2:1 | 1.9-2.1 | 1.9-2.1 | 干冰/-80℃ |
| 拟南芥 | ＞4g | 新鲜冻存 | 干冰/-80℃ | ||
| 动物组织 | ＞1g | 新鲜冻存 | 干冰/-80℃ | ||
| 细胞 | ＞1.0*108 | 去除培养液加上裂解液/新鲜冻存 | 干冰/-80℃ | ||
| 种子 | ＞8g | 新鲜冻存 | 干冰/-80℃ | ||
| 烟草 | ＞4g | 新鲜冻存 | 干冰/-80℃ | ||
| 根茎 | ＞8g | 新鲜冻存 | 干冰/-80℃ | ||
| 水稻叶片 | ＞4g | 新鲜冻存 | 干冰/-80℃ | ||
筛库服务大纲
| 膜体系双杂筛库 | |||
|---|---|---|---|
| 实验阶段 | 质控标准 | 周期（工作日） | |
| 诱饵质粒的合成及扩增 | 诱饵质粒 | 15-20 | |
| 自激活检测及毒性检测+功能验证 | 自激活检测图片+功能验证图片 | 5-7 | |
| 自激活抑制（如没有自激活，跳过这个步骤） | 自激活抑制图片(45mM3-AT浓度不能抑制实验结束) | 5-7 | |
| 初筛 | 初筛图片 | 5-7 | |
| 复筛 | 复筛图片 | 2-4 | |
| 阳性克隆测序 | 测序及分析结果+阳性克隆菌液 | 2-4 | |
| 一对一验证（点对点） | 验证图片+验证的AD质粒 | 5-7 | |
| 点板验证 | 验证图片 | 3-4 | |
| 项目结束 | 项目报告 | 1-2 | |
| 功能验证通过证明该诱饵适用于膜体系双杂筛库系统，功能验证没有通过实验结束。 | |||
案例展示
1. 诱饵验证
为避免因序列差异造成对后期实验结果的影响，需要对客户提供的原始克隆pBT3-N-xxxx进行测序和比对分析。
结论1：诱饵克隆xxxx序列正确，可继续进行后续实验。
2. xxxx诱饵基因毒性、自激活检测和功能验证
（1）pBT3-N-xxxx毒性检测结果：
结论2：Bait质粒pBT3-N-xxxx转入NMY51后，菌落生长情况同pBT3-N空载转化酵母后的一致，表明Bait质粒对酵母细胞无毒性。
（2）阳性对照：
（3）阴性对照：
（4）自激活检测结果：
结论3：pTSU2-APP Control Vector和pNub G-Fe65 Control Vector于DDO、TDO、QDO培养基中都有克隆生长，阳性对照实验成功。pTSU2-APP Control Vector和pPR3-N Control Vector于DDO培养基上生长但在TDO和QDO培养基上无克隆生长，阴性对照实验成功。BD基因pBT3-N-xxxx+ pPR3-N在DDO上生长，说明pBT3-N-xxxx质粒成功转入酵母菌株中，在TDO有轻微生长QDO培养基上不生长，说明pBT3-N-xxxx在NMY51酵母菌株中有轻微激活活性，可以进行后续筛选。
（5）功能验证结果：
结论4：将pOST1-NubI和pBT3-N-xxxx质粒共转化NMY51，涂布平板DDO、TDO和QDO，结果DDO有菌落生长，说明共转化成功；涂布平板TDO和QDO均有菌落生长，说明bait质粒能够适应ubiquitin系统，功能验证通过，可以进行下一步验证实验。
3. 文库筛选
（1）初筛：
结论5：初筛结果统计，使用TDO平板进行筛选，初筛筛选到48个克隆。
4. 二次筛选
为了去除假阳性将初筛平板上的克隆，将初筛平板上生长的48个克隆，全部点到QDO/X-gal平板。
结论6：复筛由图得知：二次筛选后的克隆均变蓝，所以得到48个阳性克隆。
5. 阳性克隆鉴定
将二次筛选平板上生长显蓝斑的48个阳性克隆进行菌落PCR测序，得到26个测序结果见附件二，进行NCBI比对的分析结果见附件三。
6. 第六部分阳性分离和质粒提取
7. 回转验证（部分图片）
结论7：本次筛选初筛筛选到48个克隆，经过二次筛选得到29个阳性克隆，将29个阳性克隆全部分离AD质粒进行回转验证，其中3号克隆活化失败，取消实验，其余28个质粒提取成功。28个质粒测序结果分析后发现6号、30号与阳性克隆测序结果不一致，以质粒测序结果为准。去除重复本次筛选共得到26个阳性基因。
8. 点板验证
挑取感兴趣的蛋白在DDO和QDO/A/X平板上进行稀释点板，（可依据文章需求，进行个性化展示）结果如下：
结论8：点板验证和回转验证结果一致。。
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