酵母三杂交验证pBridge- MdPP2AC-MdPTPA与pGADT7- MdSnRK2.6的相互作用实验案例
一、目的
已知 MdPP2AC已被证明分别与MdPTPA和MdSnRK2.6相互作用。然而,在MdPTPA和MdSnRK2.6之间没有发现相互作用。为探究MdPTPA在MdPP2AC与MdSnRK2.6的相互作用中的角色,进行以下实验。
二、方法
以构建到pBridge载体上的MdPTPA(MCSII位点)、MdPP2AC(MCSI位点)基因为诱饵,以构建到pGADT7载体上的MdSnRK2.6基因为猎物,进行酵母三杂交,验证三者互作关系,进而推定MdPTPA在MdPP2AC与MdSnRK2.6的相互作用中的角色。
三、材料
1.诱饵质粒:pBridge- MdPP2AC-MdPTPA
2.猎物质粒:pGADT7- MdSnRK2.6
3.Clontech酵母三杂交系统
4.培养基
5.其他贮备液: 10 × TE:0.1 M Tris-HCl(pH7.5),10 mM EDTA,高压灭菌; 10 × LiAc:1 M LiAc (pH7.5),高压灭菌。
四、实验方法及结果
(一)诱饵基因自激活检测
1. 酵母转化方法
(1)将 AH109 酵母菌种在SD-M平板上划线,30°C 培养箱倒置培养3天左右,直到克隆大小为2 - 3 mm;
(2)重复(1)3次,使AH109能够稳定合成甲硫氨酸。
(3)挑取一个酵母克隆于3 mL 的 YPDA 培养基中(15 mL 灭菌的离心管);在30°C 摇床振荡培养约16 h(过夜),至 OD600 >1.5 ;
(4)吸取5 mL至50 mL YPDA 中(250 mL三角瓶),使OD600 = 0.3 ,在30°C 摇床 230 - 250 rpm振荡培养4-5 h,直至OD600 = 0.6~0.8;
(5)室温4000 rpm离心4 min以收集菌体;
(6)倒去上清并用20 mL无菌去离子水重悬酵母;
(7)室温4000 rpm离心4 min以收集菌体,倒去上清并用1.5 mL 1.1 x TE/LiOAc溶液重悬酵母;
(8)将重悬液吸至2 mL 离心管,高速离心15 s;
(9)倒去上清并将酵母重悬于600 μL 1.1 x TE/LiOAc 溶液;
(10)按照下表构建反应:
Bait plasmid | Prey plasmid | 备注 |
pBridge-MdPP2AC-MdPTPA | pGADT7 | 自激活验证 |
(11)每管反应中加入10 μL预变性的Carrier DNA、300 μL 1 x PEG/LiOAc溶液,混匀;
(12)每管反应中加入50 μL重悬酵母感受态细胞,缓慢混匀;
(13)30°C水浴30 min,每10 min混匀一次;
(14)每管加入20 μL DMSO,混匀;
(15)42°C 水浴热激15 min,每5 min上下颠倒混匀一次;
(16)700 g离心5 min;
(17)弃掉上清,用1 mL YPDA液体培养基重新悬浮;
(18)30°C 摇床振荡复苏培养1 h;
(19)高速离心15 s;
(20)弃掉上清,用200 μL 0.9% NaCl溶液重新悬浮细胞。涂布相应的缺陷型平板。30℃ 恒温培养4d。
2. 诱饵自激活检测结果
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DDO | TDO | QDO |
在DDO/TDO/QDO上,pBridge-MdPP2AC-MdPTPA+pGADT7均能生长,证明诱饵存在自激活。需要通过在培养基中添加3-AT对诱饵的自激活进行抑制。
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QDO | QDO+5mM 3-AT | QDO+10mM 3-AT | QDO+20mM 3-AT |
由于Q+5 mM 3-AT可以抑制 Bridge-MdPP2AC-MdPTPA+pGADT7的活性,故选择此梯度作为筛选条件,继续实验。
(二)诱饵与猎物互作检测
猎物及诱饵共转AH109。方法同上,具体互作体系见下表。
Bait plasmid | Prey plasmid | 备注 |
pBridge-MdPP2AC-MdPTPA | pGADT7- MdSnRK2.6 | 实验组 |
pBridge-MdPP2AC-MdPTPA | pGADT7 | 阴性对照 |
互作结果:
由上图可看出,对照菌液点至Q+5 mM 3-AT/Q-Met+5 mM 3-AT平板后,+X-α-GAL不变蓝,测试组+X-α-GAL说明转化实验结果成功。同时,测试组菌液点至Q+5 mM 3-AT/Q-Met+5 mM 3-AT平板后,前者长势与后者相似甚至略强于后者,说明激活MdPTPA(MCSII位点)后,MdPP2AC与MdSnRK2.6的互作效果变弱。
五、结论
MdPTPA在MdPP2AC与MdSnRK2.6的互作过程中起抑制作用。
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