油菜素内酯检测小结

　　油菜素内酯是一种内源的甾醇类化合物，含有四环骨架，是一个疏水的、中性的物质，分子中只有少数羟基基团是极性部分。在被子植物的花粉、花药、种子、叶片、茎、根及幼嫩的生长组织中都含有低浓度的油菜素内酯。其合成前体CS也具有生物活性，因此也被认为是一种油菜素类酯类激素。
　　由于它极性基团少，使得它难以在传统的液质联用的ESI离子源中被离子化。而由于A环上有羟基基团，D环上有侧链。其22,23位的羟基侧链使得其被衍生化为易电离的物质成为可能。常用含氮硼酸化合物进行衍生化，硼酸部分可以在温和条件下与BRs的邻位二醇官能团发生共价反应，当用ESI-MS分析时，衍生物的含氮官能团给予BR化合物增强的电离效率。

　　虽然BRs的MS响应可以通过衍生化来提高，但是由于植物样品基质效应的复杂性，在实际植物材料中检测BRs还是不够的。在常规的SPE，HPLC分离后基质抑制作用依然存在。因此应该开发BR化合物的高效纯化方案以尽可能地去除天然存在的对植物粗提物的干扰。通常，净化过程由多个处理步骤组成，这将导致目标分子的回收率降低，所以在实际植物样品中保持BRs的干扰消除和回收之间的平衡是至关重要的。另外，植物提取物中复杂的可电离代谢物的出现将进一步抑制MS的ESI源中BRs的电离，并影响BRs的检测灵敏度。因此，新的净化策略应考虑减少或消除所有可电离的代谢物，并消除这些干扰的负面影响。通过样品预处理，痕量目标分子可以被富集，并且一些可能的污染物干扰检测可以从基质中去除。由于BL在植物中含量非常低(pg至ng级别)，而植物样品基质又十分复杂，因此检测它需要高效率的前处理方法，高灵敏度-高分辨率的检测方式。

油菜素类酯的结构特点：

结构特点：A环与B环为反式构型，这是由于C-5上的α氢决定的；
B环结构中含有6-氧或6-氧-7-氧杂环基团。尽管B环上有限修饰不会使活性丧失，但是会导致活性显著下降。如CS上的B环(7位没有氧)。
A环的C-2，C-3位的羟基应当是顺式α向。其中任一改变都会使得活性丧失。
侧链22位，23位有羟基。
侧链24位的基团可能有变化(如24-BL，28-HomoBL)，会导致一定程度的活性降低。

传统的检测手段：
植物研磨成粉末后以甲醇/氯仿萃取，再以水/氯仿分层，而后以硅胶柱收集有机相中的BR，再以Sephadex LH-20 小柱和Sep-Pak Plus C18小柱联合净化。
缺点：3-4天，过于繁琐的步骤，回收率低，不适合提取CS等物质。

我们现在的方法(参考Feifeng Huo，2012 talanta)：
80%甲醇，过Bond Elut Plexa SPE小柱加strata-X小柱。
特点：2-3天，回收率较高，但对CS类物质回收率仍不够高。

我们将会采用的新方法：
95%甲醇提取，MAX小柱联合PCX小柱净化，辅以QuEChERS净化（MAX小柱，吸附酸性干扰物；MCX小柱，去除亲水干扰物和极疏水干扰物）。DMAPBA衍生化。
1-2天，回收率较高，适用于CS类物质。

关于油菜素内酯检测的常见问题：

Q：油菜素内酯，油菜素淄醇，BR，BL，24-epiBL，28-homoBL都是什么？我们应该测哪种更有意义？
A：油菜素甾醇brassinosteroids (BRs)是一类甾醇类的，有一个四元环的植物内源激素。其活性最高，研究也最广泛的是brassinolide(BL)，也就是我们常称的油菜素内酯，在有些文献中也会把它简称为BR，另外由于其较为出名，也有人称该类激素为油菜素类酯类。24-epiBL为BL在C-24位上的顺反异构体，28-homoBL是C-28位上增加的额外的甲基。
一般来说BL是该类激素中活性最高的物质，检测其最有意义，但是其含量在大多数植物器官中都不高。24-epiBL，28-homoBL活性较低，但是在一些植物中含量稍高(但是我们没有买到标准品)。CS(castasterone)，5-Deoxo-CS(5-Deoxo- castasterone)是油菜素类酯的合成前体，有一定生物活性且含量较高，其中CS是BL合成的多种通路中的必经前体。此外还有TE、TY等合成前体，不过我们都买不到标准品(似乎只有加拿大一家公司做，不过那个公司关门了，我们通常联系的Olchenm等国外厂家没有)。我们已经订购了CS、5-Deoxo-CS的标准品，在3月后会推广这两个物质的检测，同时我们也订购了BL的内标物，以后油菜素类酯也可以以内标法检测。

Q：为什么BR不能与其他激素一起检测？
A：油菜素类酯在植物中含量很低(pg至ng级别，属于超痕量)，同时极性很弱，在ESI离子源中难以电离。因此对于它的前处理其一是要富集植物中的待测物，其二是不仅仅要去除样品中大量的此生代谢物，也要去掉其中其它微量、痕量的物质，以减少其它易电离物质对其检测的干扰。这其中就包括了其他的激素类物质。
而如果用常规激素检测的前处理方法来处理BL，会残留大量杂质，由于基质效应影响对BL检测造成干扰，降低BL的检测效率。

Q：为什么价格比其他激素要高？
A：固相萃取小柱的耗材成本，更长的实验周期，更昂贵的标准品，需要更熟练的员工，前期研发的实验成本等。

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