重组抗体表达平台

钟鼎生物重组抗体表达平台属于国内领先的服务平台，以首席科学家Dr.Louis领衔的技术团队拥有超过20年的重组蛋白表达经验和免疫学背景，我们配套了标准的万级细胞房，使用非动物源性培养基，全流程使用进口试剂耗材，在获得了抗体轻（重）链可变区的前体下，为了获得高产量的，高特异性的重组抗体蛋白，我们会在多个方面进行资源调配和合理优化，获得的每一管抗体蛋白都经过严格的质量评价。

1. 根据抗体亚型和应用要求，选择恰当的恒定区骨架质粒。目前，我们可以提供小鼠、人、兔等物种的的恒定区骨架质粒，通过重组无缝克隆方式将可变区基因连入表达载体,无需客户重新基因合成或调取。可变区测序时，尽可能挑取多个阳性克隆，确认序列无误。
2. 我们筛选出来有多条高效率的抗体分泌信号肽，一般情况下我们使用来自于利钠肽V5高效信号肽进行分泌表达，当抗体部分泌或产量偏低时，我们可能会设计并构建多种信号肽的表达质粒平行试验，筛选更好的信号肽方案。
3. 配合我们的抗体表达质粒，我们会有针对性的选择293和CHO相关细胞系，并摸索更好的细胞转染条件，实现转染试剂品牌与用量、细胞培养成本、表达量的更好配比，以期达到更经济科学的实验条件。
4. 常规实验设计中，我们根据FC的信息会选择Protein A/G对重组抗体进行纯化，不会添加额外的融合标签,对于高纯度要求的抗体，使用AKATA进一步纯化，根据纯度和量的要求额外加收费用。
5. 常规的科研级别抗体表达订单中，客户可免费使用我们的表达体系，但我们最终只交付抗体终产物，不赠送表达体系及关键的技术信息。（合作开发项目另议交付标准）

钟鼎生物抗体表达载体列表

产品编号	载体名称	载体骨架说明	纯化方案
AVH-1101	pAZ-V5-hCH-IgG1	Human IgG1 重链恒定区	Protein A / G
AVH-1102	pAZ-V5-hCH-IgG2	Human IgG2 重链恒定区	Protein A / G
AVH-1103	pAZ-V5-hCH-IgG3	Human IgG3 重链恒定区	Protein A / G
AVH-1201	pAZ-V5-hCH-IgM*3	Human IgM(allele 3) 重链恒定区	Protein G
AVH-2101	pAZ-V5-hCL-IgGκ	Human IgGκ 轻链恒定区	*
AVH-2102	pAZ-V5-hCL-IgGλ1	Human IgGλ1 轻链恒定区	*
AVH-3106	pAZ-V5-h-IgG1Fc	Human IgG1 Fc片段	Protein A
AVM-1101	pAZ-V5-mCH-IgG1	Mouse IgG1 重链恒定区	Protein A / G
AVM-1102A	pAZ-V5-mCH-IgG2A	Mouse IgG2 重链恒定区	Protein A / G
AVM-2101	pAZ-V5-mCL-IgGκ	Mouse IgGκ 轻链恒定区	*
AVM-2102	pAZ-V5-mCL-IgGλ1	Mouse IgGλ1 轻链恒定区	*
AVM-3108	pAZ-V5-m-IgG1Fc	Mouse IgG1 Fc片段	Protein A

 

抗体重组表达服务流程及报价

钟鼎生物抗体表达平台采取的是双质粒共转悬浮细胞为基础的实验策略，最终形成以自然结合成四聚体的天然构象蛋白，经过变性胶和非变性胶的双重检测，如果客户可以提供抗体特异性抗原，我们也可使用Western Blot检测。

 

重组抗体表达技术服务（基于HEK293/CHO表达系统）

抗体重组表达步骤及交付标准
1、表达体系系统选择（客户提供表达质粒的请告知质粒信息及元件说明）
可选表达载体 pAZ-V5相关系列载体 其他商业化的载体		可选表达宿主 HEK293/CHO 或其他商业化的载体
2、载体构建	实验周期	交付数据及材料	报价
A：序列分析优化 亚克隆设计 合成基因 B：亚克隆至表达载体	1周	1、基因合成报告 2、测序验证报告	免费电话 400-066-8086
3、细胞转染表达及纯化	实验周期	可交付数据及实验材料
C：无内毒素质粒提取 D：细胞瞬时转染 E：表达小试，条件优化 F：表达分析鉴定（SDS-PAGE） G：ELISA效价检测 H.Protein A/G亲和纯化 I：重组抗体鉴定	1周	5、瞬时转染的细胞裂解液 （如提供需增加费用） 6、细胞上清小样 （如提供需备注说明） 7、表达分析报告 8、纯化、分析鉴定报告 9、纯化的抗体

 

 

本案例基于pAZ-V5+293T分泌表达体系，使用基因合成的方法合成重链和轻链的可变区，分别将可变区通过重组克隆的方式构建至pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ表达载体，通过双质粒瞬时转染HEK293悬浮细胞，经过通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况，经过表达验证后，扩大培养收集细胞上清并通过protien A亲和柱的亲和纯化获得目的蛋白。本案例所涉及数据及实验方法结论，未经钟鼎生物授权，任何单位及个人不得转载或盗用，违者必究！

一、实验设计
我们分析客户提供的重轻链理论序列，符合理论分子量大小，抗体蛋白也无跨膜等特殊结构，因此我们设计思路为：
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板，通过密码子优化一套更适宜HEK293T细胞系的基因序列。
1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ载体来进行实验，利用载体自带的V5信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外，重轻链蛋白在细胞上清中形成二硫键，组装成四聚体结构。
依据上述设计思路，以基因合成的方式构建pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ质粒，经过测序和酶切验证无误后，提取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293T细胞，通过western blot检测蛋白表达情况，确认蛋白表达情况，再通过Protein A亲和纯化获得80%以上目的蛋白。

二、试剂和耗材（略），培养基配方如下（略）

三、主要实验仪器 （略）

四、实验分析及设计
4.1 抗体重轻链可变区序列获得（抗体测序项目请参考单独的实验案例文件）
针对基因序列分析稀有密码子情况，分析可变区蛋白序列的跨膜结构和亲疏水性，从而决定载体设计的实验方案，由于篇幅限制，此处不做详细的累述。我们专业的技术支持会依据您提供的信息免费分析并设计实验方案。

五、实验方法及实验结果

5.1 pAZ-V5-hCH-IgG1表达质粒构建(pAZ-V5-hCL-IgGκ流程相似，此处略）
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成重链可变区基因，重组克隆连接至pAZ-V5-hCH-IgG1载体的；将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如下所示（序列略），载体结构如下；

5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件，截取部分序列示例如下

测序拼接序列与理论序列相比对，结果显示获得序列与理论序列100%匹配，比对文件截图如下所示

5.3 pAZ-V5-hCH-IgG1质粒酶切图与载体构建示意图如下所示：

5.4.1. 无内毒素质粒抽提
使用Sigma公司Endotoxin Free质粒重量抽提试剂盒抽提表达质粒，经LAL法测定<0.1EU/ug。
5.4.2. 待转染细胞预处理
转染前一天,将形态良好、生长旺盛处于对数生长期的HEK93T细胞用胰蛋白酶消化后稀释至4×10⁵/mL的密度，接入24孔细胞培养板,轻微振荡使细胞均匀铺在细胞板孔内，每孔500ul，用DMEM高糖培养基培养和传代细胞。平放在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养,待细胞长至80-90%汇合度时,可以开始转染操作。
5.4.3 细胞转染
取0.8ug质粒，加入50ul Optipro SFM，混匀后加入2ul 转染试剂，再次混匀后室温孵育20min。将DNA-转染试剂复合物滴加至24孔板中，轻轻混匀，37℃培养箱培养48h。
5.4.4 Western Blot检测培养上清（客户提供待测抗原）
样品上样0.01ug,上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5小时。取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1小时。用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中37℃反应1小时。 洗膜4次，每次5 分钟；用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1小时，洗膜ECL显影。
5.5.1待转染细胞准备
将处于对数生长期的293T细胞用Trypsin消化后稀释至4×10⁵/mL的密度，种于2L的滚瓶中。每个滚瓶加200ml DMEM高糖培养基，调节滚瓶转速至20转/小时，使细胞均匀贴到转瓶表面，约24小时左右，当细胞贴壁面汇合至90%时进行转染。
5.5.2 DNA预处理
取100ug无内毒素质粒，加入13ml OptiSFM，混匀后加入250ul 转染试剂，再次混匀后室温孵育20min。
5.5.3 细胞转染与表达
将DNA-转染试剂复合物滴加至滚瓶中，轻轻混匀，调节滚瓶转速20转/小时 ，37℃培养箱培养10个小时后换3% 血清的 DMEM中糖500ml，调节滚瓶转速40转/小时。表达4天后收取上清。
5.5.4 重组抗体纯化
准备ProteinA纯化柱，用5-10倍柱体积的PBS平衡柱子。细胞上清以1ml/min的速度上样至ProteinA柱。用20 mM PB缓冲液以0.5 ml/min流速洗脱杂样，至流出液OD280值到达基线。洗脱在蛋白值至核酸蛋白检测仪数值稳定不变时准备洗脱。用Elution-Buffer(0.1M Nacl, 0.1M 甘氨酸, pH 3.0) 以1 ml/min流速洗脱目的抗体，收集流出液，并用PH9.0 Tris- HCL使其pH值恢复至中性，将收集的抗体溶液加入透析袋中，用20 mMPBS（PH7.4）透析过夜，透析后的样品进行SDS-PAGE纯度分析和BCA浓度检测。

补充说明：
1、正常情况下，抗体蛋白的表达量都比较可观，但是某些突变序列产量会偏低，因此我们蛋白交付量跨度较大。
2、一般我们使用还原性和非还原性电泳检测重组抗体，如果客户需要验证抗体的特异性，需提供额外抗原使用WB检测。
3、我们使用哺乳动物细胞表达获得重组抗体，我们只承诺蛋白序列与设计相符，不承诺重组抗体具有客户预期的生理活性。
4、即使蛋白不表达或表达量极低，我们无法获得目的蛋白，我们也会提供全套的实验流程和原始照片。

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