杆状病毒-昆虫细胞系统蛋白表达服务

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杆状病毒-昆虫细胞系统蛋白表达服务

  杆状病毒载体表达系统(Baculovirus expression vector system,BEVS)凭借其稳定的实验体系、高表达水平及翻译后修饰功能而被普遍认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具,可以提供高活性的重组蛋白,解决在其它体系中无法解决的蛋白活性困难。另外,钟鼎生物配套的免费基因优化服务、蛋白设计分析服务,表达方案建议,将为您节省大量的时间和经费。


实验流程

ac-to-Bac杆状病毒baculovirus表达体系


钟鼎生物杆状病毒-昆虫细胞体系采用的是经典的Bac-to-Bac杆状病毒baculovirus表达体系,可以依据客户的需求设计优化基因序列并设计实验方案,先后帮助客户完成多种细胞因子、激酶蛋白、多结构域蛋白以及加工修饰蛋白。

昆虫细胞蛋白表达设备及实验室

 

杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达服务
杆状病毒-昆虫细胞系统可以提供高活力的重组蛋白,解决在其它体系中无法解决的蛋白活性困难,另外,钟鼎生物配套的免费基因优化服务、蛋白设计分析服务,以及表达方案建议,将为您节省大量的时间和经费。

杆状病毒-昆虫细胞表达步骤及交付标准
1、表达体系系统选择(客户提供表达菌株的略过此步骤,仅提供表达质粒的可选择宿主菌)
可选表达载体
pFastBac1可选择分泌型和胞内型,在N端或C端设计标签
可选表达宿主 Spodoptera frugiperda (草地夜蛾)卵巢细胞
SF9 SF21 High5
2.1载体构建工作 周期 交付数据及材料 报价
  • 基因优化及合成
  • 亚克隆至表达载体pFasbac1
  • 制备重组的Bacmid

合成+亚克隆
2-3周
Bacmid制备
1-2周

1、酶切/测序验证报告
2、含表达质粒的DH10
3、表达质粒
4、重组杆状病毒质粒

昆虫杆状病毒蛋白表达服务属于科研型服务项目,为了给您提供更专业、细致的服务支持

请联系order@zoonbio.com

免费电话
400-066-8086

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2.2杆粒及P1代病毒制备    
  • P1代Baculovirus 制备
  • P1代转染WB鉴定

P1代制备及鉴定1-2周

P1代表达鉴定报告
2.3杆粒及P2代病毒制备    
  • P2代Baculovirus 制备
  • P2代感染WB鉴定
P2代制备
1-2周
1ml,>107pfu/ml 病毒液(滴度为经验估值,如提供滴度检测报告需增加费用)
2.4小样纯化    
  • Ni柱亲和纯化
  • 纯度检测
表达纯化
1-2周
蛋白样品
(可提供50-500ug蛋白)
2.5 放大培养及蛋白纯化    
  • 放大培养(根据客户需求量)
  • Ni柱亲和纯化
  • 纯化蛋白检测
  • 蛋白分装发货
放大培养
2-3周
表达纯化
1-2周

蛋白纯度鉴定报告
成品蛋白
(依据表达小试结果约定)

 

杆状病毒-昆虫细胞百搭服务案例

本案例基于经典的Bac-to-Bac杆状病毒昆虫细胞表达体系,使用基因合成的方法构建pFast-bac1表达载体,包装昆虫杆状病毒转染SF9细胞,通过SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白的表达情况,并通过Ni柱的亲和纯化获得目的蛋白。未经钟鼎生物授权,任何单位及个人不得转载或盗用,违者必究!

杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达订单前分析工作:
我们使用钟鼎生物专利的Codon_Score2.0软件分析待表达蛋白的基因序列,其中绿色是频率正常的密码子(使用频率>20%),灰色是使用频率低于20%的密码子,红色表示使用频率低于10%的密码子,针对草地夜蛾sf9宿主细胞优化基因序列。同时会对蛋白的亲疏水性和跨膜结构域分析,在不影响功能的基础之上,会选取部分或者全部的蛋白序列表达,制定表达成功率最高的实验方案。

杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达前分析

一、实验设计
按照客户的预期,期望通过杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达系统以胞外分泌的形式获得目的蛋白,因此我们分析客户提供的Target-Gene序列,整个蛋白序列呈亲水性,自身不带信号肽序列,并且序列本身含有昆虫细胞的稀有密码子,因此我们设计思路为:
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板,通过密码子优化一套最适宜SF9细胞系的基因序列。
1.2、在蛋白序列N端添加GP67信号序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外,在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。
依据上述设计思路,以基因合成的方式构建pFast-bac1-target-gene表达质粒,转化后通过蓝白筛选方法获得重组的Bacmid,经PCR鉴定之后转染sf9细胞,以获得P1代病毒和P2代病毒。侵染200ml小试表达,通过western blot检测蛋白表达情况,确认蛋白表达情况,再通过Ni-resin亲和纯化获得80%以上目的蛋白

二、试剂和耗材(略),培养基配方如下(略)

三、主要实验仪器 (略)

四、实验方法及结果
1、pFast-bac1-XXX质粒构建
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因,双酶切连接至pFast-bac1载体的BamH I和Hind III之间;将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株,挑取阳性克隆子测序,测序结果拼接如下所示,单划线区为目的基因基因区域。紫色区域为酶切位点,黄色区域为GP67信号肽,绿色区域为6XHis标签(序列略)

使用Chromas软件查看测序峰图文件,截取部分序列示例如下

杆状病毒-昆虫表达质粒测序

测序拼接序列与理论序列相比对,结果显示获得序列与理论序列100%匹配,比对文件截图如下所示

杆状病毒-昆虫表达质粒序列比对

pFast-bac1-XXX质粒酶切图与载体构建示意图如下所示:

杆状病毒-昆虫细胞载体构建酶切

5.4 重组杆状病毒表达载体(Bacmid,杆粒)的构建
5.4.1 杆粒菌株转化
DH10Bac E.coli 感受态细胞冰上解冻;(2)将200ng的pFastBac1-gene转移载体缓慢加入感受态细胞中,轻轻混匀;(3)冰上放置30min,然后42℃热击90s;(4)迅速冰上静止5min; (5)向EP管里加入900 μl S.O.C.培养基;(6)37℃,225 rpm震荡摇菌4h;(7)取100μl菌液涂于含有50 mg/ml 卡那霉素,7 mg/ml 庆大霉素,10 mg/ml 四环素,100 mg/ml x-gal,and 40 mg/ml IPTG的LB平板;(8)37℃,倒置培养48h。

5.4.2 重组Bacmid质粒的鉴定
挑取3个白色单克隆菌落接种分别接种于5ml含有50 mg/ml卡那霉素,7 mg/ml 庆大霉素,10 mg/ml 四环素,摇菌,菌液PCR初步筛选阳性克隆菌。小量抽取质粒,PCR验证杆粒正确性,因杆粒大小>135Kb,酶切方式很难进行验证,故采用PCR进行验证,理论上,若目的基因成功转座至Bacmid中,那扩增产物的大小应为(2300bp+目的基因长度)

5.5转染及收获病毒
5.5.1 sf9细胞的培养
sf9细胞培养使用SF 900Ⅱ培养基培养,一般每3天分瓶传代一次。处于对数生长期细胞且细胞活力大于95%的sf9 细胞用于转染实验。
5.5.2 Sf9细胞冻存方法:
细胞培养至对数生长期,活力超过90%; 计数,使得储存浓度为1×107 /ml至2×107 /ml; 准备所需量的储存培养液,加DMSO至10%和FBS至30%,预冷培养液保存于4℃; 离心悬浮细胞或单层细胞 100×g,5min,用预冷的冻存液悬浮至所需密度; 混匀,分装至冻存管; 将冻存管放入填有脱脂棉的泡沫盒,-80℃放置1天;移入液氮罐中保存。

5.5.3 Bacmid转染sf9细胞
在六孔板中接种9×105个细胞/2ml/孔。其中培养基Grace’s medium中含有青霉素50U/ml,链霉素50ug/ml,10%FBS;(2) 27℃培养1h,使细胞贴壁; (3) 在这期间制备Bacmid与Cellfectin Reagent复合物:A. 用100ul不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)稀释1ug Bacmid(约5ul); B. 在使用前将Cellfectin Reagent倒置5~10次,使其充分混匀,取6ul Cellfectin Reagent用100ul不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)稀释; C. 将上述两种稀释液合并(总体积约210ul),轻轻混匀,室温孵育15~45min; (4) 在制备Bacmid与Cellfectin Reagent复合物期间,将六孔板中的培养基吸掉,用2ml不完全Grace’s medium(不含双抗、FBS)洗涤一次,去掉培养基; (5) 在含有210ul的复合物的管内加入800ul的不完全Graces medium(不含双抗、FBS),轻轻混匀,加到每个孔中; (6) 将六孔板内的细胞孵育5h,27℃;(7) 去掉复合物混合液,然后在每个孔中加2ml完全培养基(SF900含双抗、10%FBS);(8) 在27℃湿度培养箱中孵育72h或着直到细胞出现病毒感染迹象。上清和沉淀需要分别制备样品,待后期western blot表达鉴定使用。

5.5.4 P1病毒液的收集
当细胞出现感染迹象时,将细胞上清转移至15ml离心管中,1000rpm离心5min以去除细胞及大的碎片,可用蛋白结合率低的0.2um的滤膜过滤,滴度损失小于10%;将含病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中(一般,P1的滴度在10^6pfu/ml左右), 将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱(短期)。若长期保存,进行1ml分装,避光储存于-80℃。

5.5.5 P2病毒扩增及收获
原代病毒滴度(P1)较低,介于1×106~1×107,扩增后滴度为1×107~1×108。 50ml摇瓶中加入适量的P1病毒.
扩增病毒时可用下列公式进行计算:
MOI(Multiplicity of infection)在0.01~0.1之间,
接种量 (ml):desired MOI (phf/ml) ×(total number of cells) tlter of viral inoculum (puf/ml)
感染细胞48 h收集的病毒扩增的将近100倍,超过48h 收集的病毒质量较低。每种病毒的收集时间都有一定的差别,如在72h收集,但是随着细胞的裂解,病毒的增殖活力会受损。

5.5.6 病毒滴度检测
六孔板中细胞120万/孔,静置培养1h,病毒梯度稀释101 102 103 104 105 106 107 108 ,去掉六孔板中的上清,取106、107、108三个滴度病毒加入到六孔板中,平行对照2组,孵育1h,配置空斑培养基,每孔加入2mL空斑培养基;第四天加入中性红染色液;7-10天计数空斑数,算病毒滴度

5.6 重组蛋白表达纯化
sf9细胞以2×106/ml瓶接种于500ml细胞培养瓶中;待细胞生长至对数期,接P2代病毒感染sf9细胞;48~72h内收集细胞及上清,用于重组蛋白表达的检测。
1、依此条件方法放大培养。4℃ 10000g离心20 min,取上清;
2. 利用低压层析系统,上清液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱;
3. 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;
4. 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl,20 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0)以1 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;
5. 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0)以1 ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;
6.将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用PBS(PH7.4)进行透析过夜;
7. 进行10% SDS-PAGE分析,

5.7 Western Blot检测
1. 样品上样0.01ug。
2. 上样完毕后,聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶,再将电压升至200V直到电泳结束。
3. 电泳结束后,取下凝胶进行转膜,恒压100V转膜,约为1.5小时。
4. 电转结束后,取下膜后先用PBS洗涤4次,每次5分钟。然后置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1小时。
5. 用封闭液稀释一抗,膜在一抗稀释液中37℃反应1小时。
6. 洗膜4次,每次5 分钟;用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1小时。
7. 洗膜ECL显影。

六、实验结果

6.1 质粒鉴定结果
6.1.2 PCR鉴定结果
6.2 P2代病毒蛋白表达鉴定
6.3 病毒滴度检测,采用病毒空斑实验方法检测病毒滴度

杆状病毒-昆虫细胞表达分析

6.4 通过Ni-IDA-Resin亲和纯化目的蛋白,获得纯度约85%的目的蛋白

杆状病毒-昆虫细胞蛋白纯化

5、蛋白质鉴定
对纯化后的蛋白,依据合同约定,进一步验证蛋白质的正确性,可选的方法有western blot, MS(分子量质谱),PFM(肽指纹图谱)具体的实验案例请参照对应的服务项目,此处省略。

补充说明:
我们使用昆虫细胞体系获得蛋白,一般情况下,我们会添加信号肽让剪辑成熟的蛋白分泌至培养基中,但是并非所有的蛋白都可以按照预期顺利的分泌或表达。在尊重科研事实的基础之上,我们无法承诺所有的蛋白都可以成功表达或以分泌的形式表达。我们也不承诺获的蛋白具有客户预期的生理学活性。