摘要

    抗血清制备以后需要检测免疫反应，本文介绍间接Elisa法检测抗多肽抗体滴度。这种检测方法能从长度大于15个氨基酸的肽中筛选出抗血清。对于较短的肽链，可用生物素标记肽链或者用不同于获得抗血清时使用的肽-载体偶联体包被反应板。

材料及仪器

实验流程

1.用100μl溶解在O.1mol/L的碳酸钠盐溶液的0.2~0.5μmol/L合成肽混合液，包被96孔培养板，并确保每个孔的底部覆盖均衡。在4℃下孵育过夜或在室温条件下放置2~6h。如果肽抗原不能吸附上去，将它们溶于其他的pH4~8的缓冲液，或使用经处理的能特异结合蛋白质的微孔培养板。

2.吸弃孔内的肽溶液，将培养板在水槽上轻拍。

3.每孔加人200μl封闭液，封闭培养板小孔中依然有活性的位点，并在室温条件下孵育≥30min。每孔加入约300μl的PBST洗涤3次，并将培养板放在水槽上方轻轻拍击。

4.准备至少8份以上300μl封闭液连续稀释抗肽的抗血清溶液，范围从1:100~1:12000或更高。同样将阳性对照(血清或已知抗体)和阴性对照(无血清)连续稀释在封闭液中。添加100μl 样品或者对照到培养板各孔内并孵育≥1h。再用PBST洗涤各孔3次。为了防止交叉污染，不可将孔中添加过满。

5.按生产商的推荐浓度将偶联体探针溶于封闭液(1:1000到1:5000)。每孔内加入100μl偶联体，室温条件下放置1h。用PBST将培养板洗3或4遍。

6.加入100μl碱性磷酸酶底物溶液，室温条件下孵育≥20min,直到可以观察到溶液有黄色出现。

7.用酶联仪在405nm波长下检测其光吸收值，并找出光吸收值显著增强的抗肽的抗体。注意:用ELISA检测，样品中抗体的结合数量和平均亲和性要更优。

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