抗体亲和力与抗体亲合力

本文讲解亲和力affinity和亲合力avidity有什么区别？以及在抗体生物学中的应用。本文是一篇关于affinity和avidity的综述，主要阐述了两者的概念，一些和亲合力/亲和力相关的免疫机制，如何利用抗体工程化改变avidity以便优化抗体功能。

抗体Fab片段和抗原之间的单一结合相互作用强度被定义为亲和力，即零阶亲和力。亲合力是抗体Fab和Fc结构域介导的不同亲和力相互作用总和，可分为：一阶亲合力，指的是Fab与抗原的二价相互作用；二阶亲合力，指的是Fab-抗原和Fc-Fc或Fab-Fab的同时相互作用；三阶亲合力，指的是免疫复合物与免疫效应分子之间的相互作用。

区别	亲和力	亲合力
作用强度	一种抗原表位+1个抗原结合位点	抗原表位+多价抗体相互作用整体强度
结合位点	单表位和单结合位点	多表位抗原和多价抗体
值	吸引力和排斥力的平衡	大于单亲和力值

许多因素促成了抗体药物治疗的成功，但药效学机制的核心是抗体与其靶点的相互作用，更确切地说，是结合相互作用的亲和力和亲合力。其中亲合力被定义为多种亲和力的累积结合强度，其中亲和力由交联事件中单个非共价相互作用提供。例如，基于抗体的效应器功能是由细胞表面的多价靶点结合触发的，其中亲和力驱动的IgG分子的表面聚集作为效应器功能激活的阈值。事实上，单一的抗体-抗原结合相互作用可能不足以成功消除病原体或病变细胞，而基于单一结合作用的可溶性蛋白的中和效力是有限的，可以通过使用抗体鸡尾酒疗法来跨越数量级。最近的创新抗体形式能够利用抗体亲合力，如双特异性和多特异性抗体以及具有工程化Fc介导的效应器功能的抗体，已经引导抗体领域走向更有针对性的药物设计策略。值得注意的是，最近世界卫生组织决定修改抗体通用命名方案，并为Fc工程化抗体和多特异性抗体创建单独的目录，除了改变未经修改的抗体和抗体片段的命名，还强调了这些作为人类治疗药物的新形式的成功和成熟。

1、亲合力在抗体生物学中的作用

（1）抗体功能性应答

在自然免疫和抗体治疗中，亲合力对于抗体-抗原识别的重要性很早就已经被认识到。抗体对抗感染的主要机制是通过结合并直接中和致病性靶标抗原，阻止其与宿主受体的相互作用并阻止其功能，如介导病毒进入细胞等。早在1937年，Burnet等人就意识到单一的抗体结合事件可能不足以灭活病毒，并认为抗体对病毒的中和作用是通过多价抗体与高比例的病毒表位结合实现的。这种多克隆免疫复合物，而非单一的分子结合事件，是下游体液和细胞应答的核心触发因素。此外，抗体的Fc结构域允许与多种存在于人体血浆中或免疫细胞上的免疫效应分子相互作用，抗原结合抗体与效应分子之间的单一结合作用通常不足以引起有效的Fc介导的应答。总的来说，通过Fab和Fc的亲合力结合相互作用---铰链的调节作用---构成了一个非常敏感的适应系统，迅速启动和放大不同的效应机制来对抗疾病。

管理功能性抗体应答的应答动力学和阈值可以被定义为是不同激活阶段的净结果，包括抗体对抗原的扫描（零阶亲合力），抗原-抗体结合和复合物形成(一阶亲合力)，抗原-抗体在细胞表面形成簇，同时形成Fc-Fc和Fab-Fab分子间接触（二阶亲合力），以及Fc介导的免疫效应分子的结合达到触发功能应答放大的阈值（三阶亲合力）。这些阶段之后是反应的调节和限制（图1）。结合和解离速率常数和局部浓度决定了抗体结合动力学的结合速度和解离速度，当结合速度快于解离速度时，倾向于形成复合物。在不同的效应系统中，达到激活阈值所需的条件各不相同；例如，不同类型的效应器机制需要不同的抗体浓度，因为它们是在不同的靶点占有水平上被触发的（图2）。其他因素包括抗原的表达和分布、不同的免疫球蛋白亚类和效应元素，如补体因子、效应细胞亚型、Fc受体亚型、多态性和表达水平也会影响抗体相互作用的整体亲合力和由此产生的功能性应答的放大。应答的调节和限制是由与靶点相关的输出引起的，如目标细胞的消除，目标密度下降到放大阈值以下或抑制表达在目标或效应细胞上的调节分子或从血浆中募集的调节分子。同样，系统性调控可以发生在效应分子或细胞短缺时，或通过干扰性免疫球蛋白的存在进行调节。反之，调节不足可能导致自身免疫，因为抗体功能性应答过度或组成性激活。

图1

（2）体液适应性免疫应答

亲合力在体液免疫中的作用在免疫启动早期就很明显了。在一个持续的免疫应答中，B细胞的克隆选择和亲和力成熟可以推动Fab结构域的内在亲和力达到10-10 mol l-1。此外，从IgM转换成IgG、IgA、IgE和它们的亚型导致了抗体Fc结构域和相关功能性特性的转换。相反，B细胞的激活受制于Fc介导的抗体反馈的生理控制机制，分泌的抗体通过形成抗体-抗原免疫复合物，即与BCR结合的抗原相互作用的情况下，共同参与抑制性IgG Fc受体IIb的作用(FcγRIIB)，来抑制B细胞激活。BCR和FcγRIIB的亲合力偶联，导致BCR复合体信号的抑制性反馈，通过在FcγRIIB的细胞质尾部基于免疫受体酪氨酸的抑制性模体（ITIM）募集的磷酸酶介导（图3a）。

（3）Fc介导的效应器功能

经典的抗体Fc介导的效应器机制，如补体依赖的细胞毒作用（CDC）、抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）和抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP），是消除病原体和疾病细胞，如感染细胞或癌细胞的关键机制。虽然很长时间以来都认为通过Fab结构域结合抗原以及Fc结构域介导效应功能激活这是两个独立的过程，但许多研究结果挑战了这种认知，可能存在一种优势构象用于不同效应器功能。除了不同的激活Fc的密度需求（图2），还有越来越多的证据表明异构或分子内协同的存在；例如，补体激活所需的最佳免疫复合物的比例可能由IgG的Fc-Fc相互作用来促进，并由其Fab结构域来调节。Fab和Fc的功能甚至可以被认为是相互依赖的，因为有效的补体激活需要细胞结合的IgG通过抗原-Fab和Fc-Fc之间强有力的相互作用来聚集成簇，从而形成最佳的对接点以便招募C1q。此外，最近研究证实IgG-抗原复合物与FcγRIIIA的结合之所以稳定是因为与IgG轻链恒定区的接触以及Fab和Fc的构象变化。因此，一阶和二阶亲合相互作用是三阶亲合相互作用和由此产生的功能应答的先决条件。

图2

（4）中和作用

Fab结构域介导的中和作用是最直接的机制，通过此机制抗原和病原体可以被灭活。事实上，结合亲和力是一些非常成功的治疗性抗体效力的主要驱动力，即中和细胞因子、生长因子或补体因子。Fab结构域与特定致病结构结合防止其与宿主细胞的相互作用，从而阻断毒素活性或病毒进入细胞。虽然高效的中和作用从根本上说是取决于强大的亲和力，但最近的研究提供了令人信服的证据，表明有额外的亲和机制优化病原体的识别。例如，特定恶性疟原虫环孢子虫的重复性蛋白（PfCSP）表位的重复性，促使在重复区域特定抗体之间选择同型Fab-Fab相互作用（图3b）。这些二阶亲和力的相互作用可能会增加B细胞受体的聚集和PfCSP应答B细胞的选择性克隆扩增。

重复微生物表位的选择压力的一个最突出的例子是在抗HIV-1人抗体2G12中观察到的重链可变(VH)结构域互换，它能与HIV-1包膜糖蛋白亚单位gp120上的保守碳水化合物进行多价相互作用。由两条轻链介导的两条重链接触形成了一个大而坚硬的结合机构域，其中新的VH-VH界面形成了一个额外的抗原结合位点以增加与聚糖结构的接触（图3b，右）。值得注意的是，进一步的研究表明，存在一个超分子抗体结构，由2G12二聚体组成有两个大的（Fab）2结合单元和两个Fc结构域，提供比单体2G12大50倍的中和效力。我们注意到，尽管该抗体的种系前体采用了传统的结构，但五个体细胞突变足以进行结构域互换，这表明这种独特结构的重排可以被用来产生治疗性抗体（类似2G12的），靶向其他病毒上的碳水化合物表位。

图3

在抗体介导的中和毒素和病毒的过程中，HIV-1本身就是亲和力在此过程中具有至关重要作用的一个例子，它通过阻碍二价高亲和力抗体的结合来逃避中和抗体，此外还有其他机制，如其快速的突变率和对三聚体穗状蛋白上保守表位的保护。因此，针对HIV-1包膜糖蛋白的抗体被认为主要是单价的与病毒表面结合。一些研究表明，之所以能规避二价抗体的结合是由于穗状蛋白在病毒表面的密度低，而且在病毒穗状蛋白三聚体上表位的分布不利，从而限制了穗间和穗内的交联（图3b，右）。相比之下，靶向病毒的抗体，如流感和呼吸道合胞病毒，可以二价结合，从而利用二阶亲合力效应。

通常情况下，Fc结构域介导的三阶亲合力相互作用，通过在免疫细胞上募集补体或FcγRs来增强毒素或病原体的失活（图2）。以HIV-1为例，广义中和抗体在体内的保护作用(bNAbs)是增强的，因为抗体具有Fc结构域能够参与激活FcγRs。同样地，在一个精细的Fc工程化方法中，Gunn和同事最近使用了一个具有相同Fab结构域的Fc变体库来证明FcγR介导的效应器功能和补体激活在抗体介导的抵抗埃博拉病毒感染中的重要性。

效应器功能的潜在有害影响，如抗体依赖的病毒感染增强，是一个重要的设计考量。病毒结合的抗体和FcγRs或补体受体之间的相互作用可能会增强病毒的进入和在吞噬细胞中的复制，正如已经证明的如登革热病毒等黄病毒。靶向登革热病毒包膜糖蛋白上不同表位的抗体的鸡尾酒疗法以及通过工程施化来减少FcγR的结合（L234A-L235A突变），可诱发有效的登革热病毒中和而不引发感染。这表明在多克隆抗体混合物中增强一阶和二阶亲合力的相互作用，同时将三阶亲合力的相互作用强度降到最低可能是在某些情况下获得最佳保护的关键。

（5）自身免疫

自身抗体对自身抗原的亲合力程度可以增加其致病性，这一点从以下方面得到证明，单独给予猴子抗乙酰胆碱受体的二价IgG1抗体可诱发其重症肌无力症状，但与IgG4抗体联合给药时则不能。这可以解释为血浆中的IgG4抗体不参与一阶Fab介导的亲合力相互作用，因为它们在体内通过特异性不相关Fab臂之间的动态交换而变成功能性单价抗体。值得注意的是，人和猕猴IgG4抗体之间的种间交换比种内交换更高效，因为人/猕猴IgG4异源二聚体的稳定性更高，这可能有利于所观察到的效果。矛盾的是，亲合力结合也可能改善自身免疫性疾病，正如肌肉特异性激酶的自身抗体引起的重症肌无力一样。通过MuSK传递的信号在维持神经肌肉连接方面具有重要作用，最近的一项研究表明，单特异性、功能二价抗MuSK抗体可作为部分激动剂，比双特异性、功能单价的IgG4抗MuSK抗体的致病性要小，因为后者消除了MuSK信号。这些发现表明IgG4分子缺乏一阶亲合力可能是其他IgG4介导的自身免疫疾病的致病机制。

（6）补体激活

补体系统是一种强大的先天免疫防御机制，由可以杀死病原体并吸引免疫效应细胞的酶级联放大系统组成。补体是通过三种不同的途径激活的：经典途径、凝集素途径和替代途径，这三种途径分别依赖于C1q、甘露聚糖结合的凝集素或自发激活的补体与病原体表面的结合。所有的途径最终都汇集在生成C3和C5转化酶，并在此基础上协同生成Opsonins、Anaphylatoxins、chemoattractants以及形成膜攻击复合物，破坏靶细胞膜以杀死细胞。

（7）FcR介导的细胞效应器功能

FcγRs以不同亲和力与不同的人IgG亚型结合。只有FcγRI能与单体IgG以高亲和力（纳摩尔范围）的方式结合，因此可能会妨碍体内免疫复合物中的亲合相互作用，因为该受体可能因血清中IgG含量高而接近饱和。炎症期间细胞因子的刺激可能会诱发FcγRI在膜微结构域上的聚集，从而促进免疫复合物而非单体IgG的亲合结合。所有其他FcγRs对单体IgG都表现出低的，微摩尔级别的亲和力，因此，在生理情况下，IgG的结合需要三阶亲合力的相互作用，从而防止在没有致病触发因素的情况下，效应细胞被不适当地激活。细胞结合的IgG的多聚体加强了FcγR结合的相互作用，超过通过免疫受体酪氨酸激活模体（ITAM）的磷酸化触发受体信号传导的阈值，这反过来又导致通过ADCC或ADCP消灭靶细胞。值得注意的是，FcγRIIIA--负责介导自然杀伤（NK）细胞的ADCC--结合去岩澡糖基化的IgG，其亲和力是岩藻糖基化IgG的40倍。这一点与免疫调节的相关性表现在针对包膜病毒膜抗原的去岩藻糖基化的IgG是选择性产生的，通过一种尚不清楚的机制引发---而去岩藻糖基化的程度与COVID-19和登革病毒出血热的严重程度相关。孕期拮抗红血球和血小板的抗体应答中也观察到类似现象。这表明通过调节Fc受体的亲和力来微调三阶亲合相互作用是一种自然的保护自己免受感染的机制，如果调节不足，疾病风险会增加。

2、治疗性抗体亲合力工程化

抗体已经被广泛地用于治疗许多疾病，包括癌症、传染病、炎症和自身免疫性疾病。与当代药物疗法相比，针对难以成药的靶点设计药物能给患者带来有意义的改善，这使得抗体药物的开发从传统的IgG抗体转向具有新功能的形式。考虑到单一特异性所带来的限制，寻找增强抗体功能的方法并不令人惊讶；事实上，使用单克隆抗体作为单一治疗性药物似乎是矛盾的，因为事实上，使用单克隆抗体作为治疗的单一制剂似乎是矛盾的，因为在自然免疫应答过程中产生的抗体具有多克隆性、亲合力调整的性质。

（1）亲合力工程工具箱

正在出现一种广泛的新型抗体工程策略和增强或调整亲合力的形式。这些策略包括那些可以优化生理免疫途径的策略，如效应器功能的增强以及那些能使非天然作用机制的策略，例如效应细胞重定向或受体激动。

下面，我们描述了一个 "亲合力工程工具箱"并讨论不同策略对抗体功能应答激活不同阶段的影响，如上文和图1中定义的。亲合力工程化策略包括靶向多个表位；靶向多个细胞表面的顺式受体；调整抗体效价；以及调整补体或FcγRs的结合强度。采用这些工程化策略的抗体疗法已经进入了临床开发阶段，并且截至2022年5月，商业化的临床管线中有35个项目平衡亲合力以增加抗体功能（表1）。下面将强调几种关键的工程化方法，利用亲合力激发抗体功能应答。

（2）多特异性靶向

近年来，引入越来越多的抗体format技术，这些技术通过靶向多个表位或靶点提高抗体的结合力。虽然这些抗体最初是为了通过靶向多个疾病相关的抗原或信号通路来提高选择性而开发的，但多靶点的概念可能在抗体功能应答的早期阶段，通过促进亲合力相互作用同时增强功能活性。多靶点概念是具有不同特异性的两个或多个抗体分子的组合---例如，抗体混合物或设计者多克隆抗体--- 在一个抗体分子中联合两个或更多特异性的抗体结构或format，如双特异性或多特异性抗体。

a、瞄准多个表位

多靶点抗体技术是利用一阶和二阶亲合力的相互作用，在同一靶点上指向非重叠表位，因为它们发生在天然的多克隆抗体应答中。这些技术可以提高靶点的占有率和局部Fc结构域密度，以提高抗体的聚集和整体的功能活性，有些甚至可能导致新功能的出现。例如，在针对致癌驱动因素EGFR和MET的单独研究中，靶向同一细胞表面受体上的非重叠表位的两种抗体组合显示出比单一抗体更强的抗肿瘤活性，在临床前和临床研究中。EGFR和MET抗体组合都能促进受体内化和降解，对于EGFR来说，这可能是由于受体交联增强以及能在去污剂不溶的、血浆膜相关小管上聚集。受体内化的增加也可以通过使用多特异性抗体形式实现。目前正在开发单独针对HER2和MET的二元抗体以诱导靶受体的降解，或者，作为双特异性抗体药物偶联物，它依赖于偶联药物的高效内化以达到最佳的细胞毒性（表1）。目前还在开发加强中和作用的二元抗体，正如最近的一项研究中所描述的那样，与亲本抗体混合物相比，双抗体通过非活性状态下冻结外切酶活性，卓越的抑制CD73外核苷酸酶的活性。

经典的Fc介导的效应器功能可以通过多表位靶向来加强。靶向MET或EGFR的多个表位的抗体组合可以比靶向任意蛋白单个表位的单克隆抗体更有力地触发补体的激活。通过多表位靶向而增强CDC作用也在其他一些细胞表面靶点也报道过，包括CD37、人类白细胞抗原（HLA）、奈瑟尔脑膜炎因子H结合蛋白、叶酸受体α（FRα）以及使用工程化的双特异性仅有重链的抗体构建体靶向CD38来拮抗多发性骨髓瘤和霍奇金淋巴瘤细胞系。我们推测，多特异性抗体的亲合力工程化可以有效地克服补体防御机制，通过增加二阶亲合力相互作用，利用抗体自然六聚化来诱导CDC。

使用多特异性抗体技术靶向非重叠表位已被用来减少病毒抗性，降低病毒逃逸风险。三特异性抗体形式结合了广义中和抗体的Fab来源的结构域(bNAbs)，可针对信封蛋白刺突上不同功能的HIV-1表位，与体内外亲本bNAbs联合相比，这种三抗针对更多不同的HIV-1分离物表现出更大的中和作用和活性。

通过靶向单一抗原上的多个不重叠表位来增强抗体结合的形式代表了平衡亲合力调整的最大一组临床方案（表1）。这种形式从两个或多个非竞争性抗体的混合物到双特异性或多特异性抗体，将不同表位结合特异性聚集到一个单一的分子上。例如，多个临床项目正在研究针对在多个实体瘤适应症中过表达的靶向EGFR家族成员上多个表位的治疗方案，临床数据显示，最初对EGFR特异性抗体有应答的患者最终都会产生耐药性。使用抗EGFR抗体鸡尾酒Sym004疗法，包含futuximab和modotuximab（Symphogen）的一项概念验证研究表明该疗法对西妥昔单抗有获得性EGFR突变介导的耐药的转移性结直肠癌患者的临床活性。使用Sym004治疗的未经选择的患者在一项II期研究中没有显示出总生存期的增加，虽然一项回顾性分析表明RAS/BRAF/EGFR胞外结构域突变阴性的患者亚组有生存获益。(NCT02083653)。

表1

多表位靶向抗体鸡尾酒疗法正在被探索用于预防或治疗感染高度变异的RNA病毒严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。Casirivimab和imdevimab（Regeneron，NCT04381936）联合给药针对SARS-CoV-2 S糖蛋白上的非重叠表位证明可以防止体外选择一个表达SARS-CoV-2 S糖蛋白的假病毒的逃避突变体，而针对重叠表位的单个抗体或组合抗体的存在的情况下，很快就会出现中和逃逸。发现该鸡尾酒疗法对SARS-COV-2的Omicron BA.1变体没有活性，但它确实中和新出现的omicron BA.2亚变体，尽管效力下降了两个数量级。最近的一项研究使用SARS-CoV-2感染的体内外模型，证明两种有效的中和非竞争性抗体起协同作用。这些抗体已被优化成半衰期延长及FcγR和C1q结合减少，目前正在开发tixagevimab和cilgavimab（AstraZeneca，NCT04625725）。应该注意的是，Fc突变抗体的三阶亲合相互作用潜力降低将无法利用Fc介导的效应器功能在体内治疗中起作用，尽管这些突变会减少潜在的Fc介导的疾病风险。

一个三特异性抗体的一期临床试验正在探索多表位靶向，该抗体包含了三个bNAbs的结合结构域（VRC01LS、PGDM1400和10E8v4（赛诺菲））针对HIV-1包膜刺突（NCT03705169）。此外，三种非竞争性IgG1的鸡尾酒疗法，即阿托伐单抗、maftivimab 和 odesivimab(REGN-EB3, Regeneron)最近被批准用于治疗扎伊尔埃博拉病毒病毒（ZEBOV）（NCT03576690）。这些抗体是因为它们具有同时结合ZEBOV糖蛋白的能力而选出来的，并以去岩藻糖基化的IgGs形式生产，由于Fc介导的效应器功能在避免埃博拉病毒感染方面的作用。

b、顺式靶向多个细胞表面受体

靶向两个或多个细胞表面受体的抗体鸡尾酒疗法是一个典型的亲合力工程化的例子，利用天然多克隆抗体应答的经验。靶向多个细胞表面受体可以增加抗体的占有率（图3d）和抗原的聚集，通过交联和Fc-Fc相互作用等方式，致使三阶亲合力相互作用增强。我们最近描述了一组共同参与异源六聚体复合物的由两种抗体组成的混合物，上述两种抗体靶向肿瘤B细胞上的CD20和CD37抗原，因此增强了补体的激活（图4a，右）。Jacobsen及其同事报告了一组由六种抗体组成的混合物，在协同作用下，靶向每个HER家族成员EGFR、HER2和HER3。这种混合物被称为Pan-HER（Sym013、Sym013，Symphogen）可以下调所有三个靶点的表达，并克服由代偿性受体上调引起的表达HER家族肿瘤的获得性耐药；这种鸡尾酒疗法进入临床开发阶段，但在I期后被终止(NCT02906670)。

图4

靶向多个细胞表面受体的其他方法包括以双特异性或多特异性抗体的形式将多种结合特异性组合到一个单分子中，在同一细胞上连接不同的受体（顺式）或在不同细胞上（反式）连接不同受体。双特异性或多特异性抗体的优势之一是他们有能力激活新的 "设计 "功能，这是由抗体混合物无法实现的(对于双特异性抗体而言，这些被称为 "强制 "机制）。此外，它们可以通过局部拴住受体来增加其治疗指数，可以将治疗活性集中到偏爱的细胞或组织，并限制靶向和非肿瘤毒性。这个概念是利用了亲合力结合的一个特殊方面，被称为跨臂结合，在这种情况下，第一个结合事件将第二个结合臂限制在一个较小的范围内，从而增加其有效浓度和结合概率。值得注意的是，通过跨臂结合实现亲合力的增加高度依赖于表位、靶点表达水平、抗体形式和效价。

最广泛研究的 "强制性 "双特异性抗体采用反式桥接来重定向T细胞或其他效应器的细胞毒活性，以消除肿瘤细胞。我们请读者参考最近的综述以对这种重要的治疗性抗体进行更深入的讨论。

一个有趣的例子说明了顺式桥接是如何解除由amivantamab引起的强制性机制的（表1），该抗体是一个最近被FDA和EMA批准的双特异性抗体靶向EGFR和MET的双特异性抗体（杨森公司）。使用双价抗体交联MET导致不受欢迎的肿瘤细胞激活，而amivantamab通过在一种双特异性构型中结合单一的、非交联的MET结合臂与一个EGFR结合臂，有效阻断MET和EGFR信号。

通过工程化将双特异性抗体的岩藻糖基化降低可以增加参与三阶亲合力相互作用的潜力。这个例子在亲和力调整方面值得注意，因为它说明了在设计有效的基于抗体的治疗方法时，了解抗体和靶点生物学的重要性。

可以通过单个结合结构域实现与蛋白质复合物的亲合力结合。Lameris等人最近描述了一个单域抗体，VHH1D12，针对抗原呈递糖蛋白CD1d，一种与HLA I类蛋白密切相关的糖脂呈递分子。VHH1D12能同时与CD1d和I型自然杀伤性T细胞受体（TCR）相互作用，由于CD1d-TCR的交联，从而引发I型自然杀伤性T（NKT）细胞的抗肿瘤活性。单一抗体结合位点与多种蛋白质或结构相互作用的能力之前已经在针对HIV-1的抗体种描述过，该抗体的多反应性增加了观察到的对病毒体的亲和力。具体来说，针对HIV包膜糖蛋白的膜近端区域(MPER)的bNAbs与gp41亚单位合病毒脂膜相互作用。

受体的顺式和反式桥接的联合也可以通过在双特异性抗体上设计额外的抗体片段来实现，从而创建能够同时靶向多种细胞类型和同一细胞多个受体的三特异性或多特异性抗体。例如，三特异性抗体LAVA-051 (Lava therapeutics)--- VHH1D12与另一个靶向γδT细胞上Vγ9Vδ2 TCR的单域抗体相连---招募I型NKT细胞和Vγ9Vδ2 T细胞进行肿瘤细胞杀伤。目前LAVA-051正研究作为下一代T细胞诱导剂用于治疗血液病（NCT04887259）（表1）。在另一个例子中，Shivange及其同事最近报道了一种单剂的产生，双特异性锚定的细胞毒激活剂（BaCa），这种抗体能共同参与死亡受体5（DR5，也称为TRAIL-R2）和FRα，两者都在卵巢癌细胞上表达。据报道，BaCa抗体能与FRα结合并以顺式和反式形式与DR5交联，FRα作为肿瘤特异性锚定位点和DR5激动剂信号的主要聚集点。与交叉臂结合带来的亲合力增加相一致的是，与反式杀伤相比，顺式杀伤需要较低的抗体浓度。

（3）通过抗体效价调整亲合力

在过去的几年里，工程化策略增强抗体聚集以改善抗体性能主要是为了增加抗体的效价，通过在片段和类似IgG或IgM的结构中复制抗体结合或Fc结构域。事实上，一些研究报道设计含有多个Fc结构域的抗体形式以加强FcγR交联和ADCC。在最近的一项研究中，Miller和他的同事对肿瘤抑制因子P53的四聚化结构进行了调整，将其与不同的抗原结合结构域融合创造出八价单特异性和双特异性抗体变体，其具有更高的功能活性，被称为四元抗体。此外，所有四种人IgG同种型的CDC都可以通过共价六聚体化来增强，这是通过将IgM的18个氨基酸的μ-尾部与它们的羧基末端融合而实现的，从而产生多价结构，有效地结合和激活补体。

一些受体，包括那些具有多聚体认知的配体或那些在细胞-细胞突触处相互作用的受体、需要相邻复合物的高阶低聚体化以激活下游信号的受体。这类受体中研究最广泛的是肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF），由于它们在调控细胞生存和炎症信号传导方面的作用，药物开发者对这些受体的兴趣越来越大。靶向这些受体的免疫调节抗体的常规结合通常不足以诱导TNFRSF聚集，许多需要通过FcγRs进行额外的三阶亲合力结合，特别是FcγRIIB，在免疫效应细胞上参与激动剂活性。由Ashkenazi、Presta 和同事们进行的开拓性工作证明通过使用串联的Fab重复序列增加效价来进行亲合工程化，可以增强靶向TNFRSF DR5抗体的前向信号活性。以前开发TNFRSF靶向抗体的努力仅取得了有限的临床成功，可能是由于FcγR介导的交联不足以及在某些情况下出现不良反应或毒性。人们对靶向TNFRSF的兴趣已经恢复了，这是因为使用了高效价的形式实现了卓越的交联和独立于三阶亲合力与Fc受体相互作用的信号。目前，四个效价提高的TNFR靶向分子已进入早期临床试验，包括IGM-8444(IGM Biosciences)，一种靶向DR5的基于IgM的五聚抗体（NCT04553692）；INBRX-109(Inhibrx)，一种包含多个配体结合结构域与靶向DR5的Fc结构域融合的四价形式（NCT03715933，NCT04950075）；六价的形式的INBRX-106（Inhibrx，NCT04198766）和ABBV-621 (AbbVie, NCT03082209)，分别靶向OX40和TRAIL。

独立于FcγR交联的进一步加强TNFRSF激活的方法包括使用具有六个TNFRSF结合结构域与Fc融合，α1(I)胶原蛋白的三聚C前肽与Fc融合、IgM以及四价二元靶向概念（图4b，左）。六价受体激动剂（HERA）技术利用单链三聚体肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）配体结构域融合到一个沉默的IgG1衍生的Fc结构域上，以增强CD40、糖皮质激素诱导的TNFRSF相关蛋白（GITR）和CD27，并提高抗原特异性T细胞的应答。同样，使用不同四价(2+2)双靶点抗体形式联合参与DR5和OX40的多价和多表位能诱导激动信号，不需要额外的FcγR交联。

虽然通过提高效价来调整亲合力代表了一种有希望的方法，增强TNFRSF的激动作用，但对于某些靶点来说，活性必须与安全性相平衡。例如，高剂量的激动性CD40抗体治疗通常与不良的临床事件有关，如细胞因子释放综合征和肝毒性。使用多个靶向CD40的抗体和配体的研究证明，具有不同结合方向合效价的分子之间的生物应答明显不同。CD40激动性抗体的表位是至关重要的，因为同时结合抗体和天然三价配体可能会导致过度聚集和不受控制的过度刺激。此外，广泛的FcγR交联可能会增加Fc结构域驱动的副作用，如不必要的表达CD40的免疫细胞群的耗竭或表达FcγR的细胞的免疫应答过度刺激。事实上后者在小鼠模型中得到证实，在该模型中用靶向集落刺激因子1受体（CSF1）的抗体阻断巨噬细胞的激活，消除CD40抗体介导的肝毒性。另外一个意想不到的毒性例子是在TAS 266的临床I期试验中观察到的，该药是一种针对DR5的四价激动型纳米抗体，其中肝毒性与出现的抗药抗体介导的过度交联相关。总而言之，这些研究都表明，对于亲合力工程化生物治疗激动剂药物而言，精心设计和严格的临床前调查非常重要。

详述以下内容的研究一直在稳步增加的工程和临床转化。天然的多价免疫球蛋白同种异型，如IgM和IgM和IgA，的工程化和临床转化的研究不断增加，尽管它们比IgG的开发更具挑战性，因为它们具有更复杂的多链结构、更加广泛和异质的糖基化模式和较短的体内半衰期。在一个独特的眼部应用中，Agard及其同事使用了天然IgM的多价性有效地激动了酪氨酸蛋白激酶受体TIE2；这一应用利用IgM的大尺寸来减少玻璃体的清除率，而清除率又与分子的流体力学半径成反比。

（4）通过低聚化调控亲合力

IgG在抗原表面通过Fc-Fc相互作用自我组装成有序的低聚物的能力可以用在治疗应用以及设计和开发具有标准结构的IgG抗体上，这要比与预组装的抗体多聚体更为简单。De Jong和同事报告了一种新的HexaBody技术平台，该平台利用Fc结构域的特定单点突变来提高靶点依赖的自组装，促使IgG分子在细胞表面形成六聚体复合物（图4b，右）。在一个突变筛选方法中，他们在Fc区域发现两个保守的谷氨酸残基--E345和E430，替换成任何其他氨基酸都会增强IgG六聚体的形成和补体的激活，能用于广泛的细胞表面靶点。Sopp等人证明依赖靶点结合的自我组装也可以通过偶联上文提到的μ尾部延长IgG1抗体，但其中的羧基末端的半胱氨酸被突变成丝氨酸以防止共价六聚体化。通过系统地耗尽个别补体成分，Talylor等人表明含有六聚体增强突变的抗体需要减少膜攻击复合体形成的补体成分的存在，以促进CDC的发展，而不是像未突变的母体那样。如前所述，在抗原表面上自组装的六聚化增强抗体致使IgG六聚体密度增加，因此可能导致较低的补体激活阈值，与常规IgG相比。

通过促进抗体的自组装来增强抗体的聚类可能在扩增 "设计"的抗体功能，如激动性受体信号，上也有特殊应用。在靶向DR5的抗体中引入六聚体化增强突变是一种有效的诱导肿瘤细胞死亡的策略；最近，一种由两个非竞争性的、针对DR5的抗体组成的新型混合物，上述抗体含有E430G六聚化增强突变，被证明在多种肿瘤类型中可以不受FcγR交联的影响改善DR5的信号传导和肿瘤细胞的死亡。两种IgG分子间的Fc-Fc相互作用是DR5激动活性的关键，而与补体成分C1q的结合有助于体外和体内的效力，可能是由于三阶亲合力结合稳定IgG六聚体的原因。将多表位靶向与加强六聚体化相结合的方式正在进行临床试验，例如双特异性分子GEN3009(Genmab/AbbVie)针对CD37的血液恶性肿瘤（NCT04358458）。一项使用六聚体增强的抗体混合物GEN1029(Genmab)靶向实体肿瘤DR5的I期研究最近被终止（NCT03576131）。

除了靶向肿瘤细胞上的TRAIL受体外，还致力于靶向免疫细胞上的TNFRSF--如OX40受体、CD27、CD40、CD137和GITR -- 使用激动型抗体来刺激T细胞的增殖和细胞毒活性。调整这类抗体的亲合力已在改善其功能效果方面显示出前景。对于OX40，抗体进行六聚体化增强Fc突变可以增加它们的激动活性。

（5）调整与补体和FcγRs的结合

对Fc结构域进行工程化以增强其与免疫效应分子的亲和力，目的是在较低的抗体密度或抗体免疫复合物浓度下通过增加靶点占用率或通过延长相互作用的时间（由于解离速率降低），降低激活阈值。IgG亚类的Fc区域对C1q的亲和力以及激活补体的能力不同(方框2)，因此将不同IgG亚类的片段进行重新组合已被证明是一种成功增加结合力的工程化策略。一些研究小组通过突变Fc区域的氨基酸，包括在S267, H268, S324, K326、E333增强C1q的结合亲和力和CDC（图4c，左）。对C1q亲和力的增加必须仔细调整，以保持一个适当的激活阈值避免在没有与抗原亲合力结合的情况下激活补体。在亲和力和亲合力工程化的比较中，Tammen等人证明与增强单体IgG对C1q的亲和力突变相比，增强目标IgG六聚体化的突变对补体介导的肿瘤细胞裂解更有效，因为部分是拮抗低EGFR表达水平的细胞。

广泛的突变分析已经确定IgG Fc区域的氨基酸位置，这些氨基酸对不同的FcγR的结合有不同的影响，可以通过修饰增强ADCC或ADCP活性。靶向EGFR、CD52和CD20的抗体的Fc结构域的S239D/I332E氨基酸替换被证明可以增强FcγRIIIA/FcγRIIB的亲和力以及增加ADCC和ADCP（图4c，右）。对Fc区域进行糖基化工程以减少岩藻糖含量也可以通过改善与FcγRIIA的结合来增强效应器功能。除了改善经典FcγR介导的效应器功能外，FcγR的结合相互作用的增强可被用来增加免疫调节性抗体的激动活性。例如，使用S267E/L328F或E267E/L328F的Fc突变增强FcγR的亲和力可以增加DR5和OX40的抗肿瘤活性。更进一步，选择性地增强抗体与FcγRIIB的结合已被用来抑制BCR介导的B细胞激活并抑制体液免疫以及增强免疫复合物的清除。

目前，有七个临床项目是应用Fc工程化来扩大FcγR介导的效应器功能(表1)。两个Fc结构域的组合单点突变（S239D/I332E）增强靶向HIV-1包膜刺突和B细胞上CD19抗体的ADCC和ADCP。Tafasitamab，一种靶向后者的抗体，最近被批准与来那度胺联用治疗复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL），Margetuximab，一种抗HER2抗体，Fc具有L235V/F243L/R292P/ Y300L/P396L突变，最近被批准用于治疗HER2阳性乳腺癌（图4c，右）。用于增强效应器功能的糖基化工程已经在五个获批的去岩藻糖基化的抗体产品取得临床成功，包括mogamulizumab（皮肤T细胞淋巴瘤），obinutuzumab（慢性淋巴细胞性白血病和滤泡淋巴瘤），benralizumab（哮喘），阿托伐单抗、马弗单抗和奥德西维单抗的鸡尾酒疗法(扎伊尔埃博拉病毒感染)和双特异性抗体amivantamab（肺癌）（图4c，右）。

最近，Ravetch及其同事证明经Fc工程化增强FcγRIIA的抗体可以增加树突状细胞的成熟并诱导保护性CD8+T细胞的抗病毒应答。

3、结论和未来展望

抗体的功能依赖抗体和靶点与效应分子和免疫系统细胞间的相互作用。有大量证据表明亲合力在天然抗体生物学中有关键作用，从免疫反应早期的抗体亲和力成熟到靶点接触后的效应器功能激活。抗体和抗原之间的特定相互作用，我们称之为零阶亲合力结合，可以从高度瞬时的（快速解离速率）变化到长期持续的（缓慢解离速率）。其次，亲合力的相互作用对抗体生物学的重要贡献是通过增加结合强度实现的，直到达到触发功能活性的阈值。我们区分了一阶亲合力（二价Fab-抗原结合），二阶亲合力（同时进行Fab-抗原和Fab-Fab或Fc-Fc相互作用）和三阶亲合力（免疫复合物和效应物之间的相互作用）。所有级别的亲合力结合都可以通过靶向多个表位的抗体应答的多克隆性得到增强。虽然抗体亲合力相互作用的阈值转化为有效的功能应答在不同的效应机制之间有所不同，但亲合力结合可以被看作是应答放大前的一个检查点，它在很大程度上决定了功能应答的有效性。了解形成抗体功能反应动力学的关键决定因素，包括多层次的抗体亲合力相互作用以及反应调节器之间的平衡，在掌握抗体作用机制和设计更有效的基于抗体疗法方面很关键。

单克隆抗体的单药治疗在很多方面都与抗体的作用机制相悖。在传统药品开发中，单药的安全性和活性通常是药品注册的必要条件，而通常只有在首次注册后才会寻求药物组合，通常利用经验组合。然而，在人体中，一个组合的多克隆应答是抗原免疫反应的起点。对这一矛盾的认识已经在稳步增长，基于抗体的疗法已经从经典的单克隆逐渐发展到更复杂的抗体结构和形式，以努力提高功能活性，并且正在临床试验中合理地设计和评估鸡尾酒疗法。

新的形式正在出现，利用抗体亲合力的相互作用来提高经典的效应器功能和新的或 "设计 "的机制。这些形式的特征是亲合力提高，包括结合特异性的倍增，提高效价，增强Fab-Fab或Fc-Fc的相互作用或增强Fc与效应分子之间的相互作用。利用这一概念，将不同的亲合力工程化方法结合起来以达到递增亲合力的效果。例如，多表位或多效价形式可以与自组装技术相结合，这可以通过效应分子进一步加强。我们相信，多药物方法将在未来的抗体治疗中扮演重要角色，无论是以有功能的双特异性/多特异性抗体的形式或设计多克隆抗体。有一种说法就是要在合理设计抗体鸡尾酒疗法方面做出更大的努力应对越来越多的进入或正在进行临床开发的治疗性抗体。值得注意的是，前瞻性的抗体发现方法，以最终形式对抗体库进行无偏见的筛选将对确定最佳的多特异性抗体或抗体组合很关键。同样，深思熟虑的抗体设计，加上工程化能力的进步和临床前表征的改进，将使亲和力优化的分子形式，更好地实现调整后的效力以平衡最大的功能活性与最小的不良事件风险。总的来说，最近对抗体效应物生物学的新认识以及目前的抗体设计工作拓展了我们的能力，超越了传统的单克隆形式，这些都为新变革的生物，这些药物可以积极地影响病人的生活。

参考文献

1、Nat Rev Drug Discov. 2022 Oct;21(10):715-735.

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