DNA pull-down 是检测目标 DNA 序列与蛋白质之间相互作用的主要方法之一。钟鼎生物生产的 DNA PullDown Kit 利用链霉亲和素磁珠与生物素的强亲和力，高效调取生物素标记的目标 DNA 序列及其结合蛋白。

首先制备生物素标记的 DNA 探针，再与动物样本裂解液孵育，DNA 探针与样本中的蛋白质结合形成复合物；链霉亲和素磁珠特异性捕获生物素 DNA 探针，同时捕获该 DNA 探针的结合蛋白；之后可以采用 WesternBlot 技术检测特定蛋白，也可以采用质谱（LC-MS/MS）技术鉴定未知蛋白。

产品优势

产品信息

货号	产品名称	规格
ZDD001-12T	DNA Pull-Down Kit	12 次
ZDD001-24T	DNA Pull-Down Kit	24 次
ZDD001-40T	DNA Pull-Down Kit	40 次

试剂盒组分

编号	名称	12T 规格	24T 规格	40T 规格	储存条件
①	链霉亲和素磁珠	500 μL	1 mL	1.7 mL	4℃，1 年
②	裂解缓冲液	7 mL	14 mL	22 mL	4℃，1 年
③	NT2 缓冲液	16 mL	32 mL	52 mL	4℃，1 年
④	漂洗液	32 μL	64 mL	110 mL	4℃，1 年
⑤	洗脱缓冲液	650 mL	1.3 mL	2.2 mL	-20℃，1 年
⑥	蛋白酶抑制剂	230 μL	460 mL	760 mL	-20℃，1 年
⑦	10 mL 离心管	1个	1个	1个	——

注意：该试剂盒包含足够完成 12、24 或 40 个反应的试剂，每个反应使用 40 μL 磁珠。由于每次 pull-down 实验至少需要设置一个实验组和一个阴性对照组，因此一次实验至少需要使用 2 个反应的试剂量。

仪器材料

1. 自备材料：DNA 凝胶回收试剂盒、核蛋白提取试剂盒（可选）、PBS。

2. 所需仪器：磁力架、混匀仪、低温离心机、超声波破碎仪。

注意事项

1. 请勿干燥或剧烈涡旋磁珠，禁止长时间置于磁场，这些操作可能会引起磁珠聚团，降低结合活性。
2. 为保证磁珠均匀分布，请在使用前通过反复颠倒、轻微涡旋彻底混匀磁珠。
3. 具体样品量和孵育时间依赖于每个特定体系，可能需要优化才能得到最大产量。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

实验步骤

DNA 探针制备

根据目标 DNA 序列设计并合成生物素标记的引物和未标记的引物，PCR 扩增分别得到生物素标记的 DNA 探针（实验组）和未标记的探针（对照组）；按照 DNA 凝胶回收试剂盒说明书进行探针的回收纯化。

操作方法

1. 蛋白提取

1.1 总蛋白提取

(1) 将两组样本（实验组+对照组）按照如下方法收集和处理：

样本类型	样本量	收集方法
动物细胞	2*107~4*10e7个	冷 PBS 漂洗 2~3 次，每次 4 ℃ 500 g 离心 5 min 收集沉淀，尽量吸干液体
动物组织	0.2~0.4 g	冷 PBS 漂洗 2~3 次，彻底去除血液等成分，用液氮在研钵中充分研磨，再转移粉末至预冷的新离心管中

(2) 样本置于冰上，加入 0.6~1 mL 预冷的②裂解缓冲液、6~10 μL ⑥蛋白酶抑制剂（按 1%添加），吹打混匀；
(3) 为了更充分裂解，最好冰上超声至溶液基本澄清，如果无超声条件，可以冰上裂解 30 min，间隔手动混匀；
(4) 4℃ 12000 g 离心 15 min，收集上清至新的离心管中；取 30 μL 作为 input，剩余上清平分为两份用于 DNApull-down 实验，记为实验组和对照组，置于冰上备用或- 80℃保存。

1.2 核蛋白提取

如果提取核蛋白，需要自备核蛋白提取试剂盒，并按照说明书操作。提取好的核蛋白取 30 μL 作为 input，剩余平分为两份用于 DNA pull-down 实验（记为实验组和对照组），置于冰上备用或- 80℃保存。

注意：1. 提取核蛋白所需的样本量约为总蛋白的两倍，但具体使用量还需要根据实际操作来摸索。
2. 当样本不能完全裂解时（溶液很浑浊），可以增加裂解缓冲液或改善超声条件继续裂解；超声条件因样本类型和超声设备而异，应提前摸索好。根据经验，样本总蛋白浓度通常不低于 5 μg/μL，总量约 2~3 mg。
3.如果样本中目标蛋白丰度较低，或结合物间的结合较弱，可以增加初始样本量，同时等比例增加裂解缓冲液和酶抑制剂的用量，但总孵育体积最大不超过离心管体积的 2/3，体积过大可以更换大规格离心管。

2. 磁珠准备

(1) 将①链霉亲和素磁珠上下颠倒混匀，取实验组和对照组一共所需的 80 μL 磁珠到新的离心管中；
(2) 加入 1 mL ③NT2 缓冲液，颠倒混匀 30 次，放磁力架上静置 1 min 并弃上清；
(3) 重复上步操作一次；
(4) 加入 400 μL ③NT2 缓冲液，上下颠倒重悬磁珠；
(5) 将磁珠平分为两份，每组各约 200 μL，转移到新的无 RNase 离心管中，记为实验组和对照组。

3. 漂洗液准备

为了防止实验过程中的蛋白降解，需要向漂洗液中添加蛋白酶抑制剂。取出⑦10 mL 离心管，加入实验组和对照组总共所需的 5 mL ④漂洗液、25 μL ⑥蛋白酶抑制剂（按 0.5%添加），混合均匀，冰上保存，现配现用。如果有多组样本，按照实际使用量配置。

4. DNA pull-down

(1) 取 3 μg 实验组和对照组 DNA 探针，分别加入对应的磁珠（步骤 2 制备）中，混匀仪上室温孵育 30 min；
(2) 放磁力架上静置 1 min 并弃上清；
(3) 每组加入 500 μL 漂洗液（步骤 3 准备），颠倒混匀 30 次，放磁力架上静置 1 min 并弃上清；
(4) 重复上步操作一次；
(5) 加入相应组别的样本裂解液（步骤 1 制备），混匀仪上 4 ℃孵育 2~4 h；
(6) 放磁力架上静置 1 min 并弃上清；
(7) 每组加入 500 μL 漂洗液（步骤 3 准备），颠倒混匀 30 次，放磁力架上静置 1 min 并弃上清；
(8) 重复上步漂洗操作两次，共漂洗三次，保留磁珠。

5. 蛋白洗脱

本说明书提供以下两种蛋白洗脱方案，操作者可以根据后期检测的需要选择合适的洗脱方法。

(1) 非变性洗脱法：向磁珠中加入 50 µL ⑤洗脱缓冲液，涡旋震荡 20 s，混匀仪上室温洗脱 10~15 min；涡旋震荡 20 s，1000 g 离心 20 s；放磁力架上静置 1 min，收集上清至新的离心管中，- 80℃保存。该洗脱产物保持原有的生物活性，适用于后期各种检测，例如质谱、SDS-PAGE 或 Western-blot 等。
(2) SDS-PAGE 上样缓冲液洗脱法（变性洗脱法）：向磁珠中加入 50 μL 1×SDS-PAGE 上样缓冲液，95 ℃加热5 min；磁力架上静置 1 min，收集上清至新的离心管中。该洗脱产物适用于 SDS-PAGE 或 Western Blot 检测；如果需要进行质谱检测，则切胶条后送检。

注意：1. 本试剂盒提供的洗脱缓冲液可以兼容质谱，钟鼎生物也可以提供蛋白的质谱检测服务。
2. 如果选择非变性洗脱法，可以暂时保留洗脱后的磁珠，当非变性洗脱效率较低时，则采用 SDS-PAGE 上样缓冲洗脱法继续洗脱蛋白。
3. DNA pull-down 捕获的蛋白量通常较少，因此 SDS-PAGE 建议用硝酸银染色，染色步骤参考如下：
(1) 固定：30 min（乙醇：乙酸：水=4：1：5 体积比）；
(2) 敏化：30 min（乙酸钠 10.2 g，硫代硫酸钠 0.471 g，乙醇 45 mL，加水至 150 mL）；
(3) 水洗：4 次，每次 10 min；
(4) 银染：30 min（硝酸银 0.375 g，加水至 150 mL）；
(5) 水洗：2 次，每次 40 s；
(6) 显色：显影至条带清楚（碳酸钠 4.5 g，72 μL 甲醛，加水至 180 mL）；
(7) 终止：5 min（Na₂EDTA 2.19 g，加水至 150 mL）。

问题解决

问题	可能原因	解决方案
获得的复合产物少	样本或蛋白量不够	提高样本用量或更换核蛋白提取试剂盒
	孵育时间不够	延长孵育时间（如孵育过夜），但需要注意孵育 时间过长也可能会导致非特异性结合增多
	DNA量不够	提高 DNA 用量
SDS-PAGE 检测有很 多非特异结合的条带	非特异性的蛋白结合在磁珠上	增加漂洗时间和次数

案例

实验目标：筛选与目标 DNA 序列结合的蛋白质。
(1) 未标记组：未标记目标 DNA 探针的 pull-down 产物（对照组）；
(2) 标记组：生物素标记目标 DNA 探针的 pull-down 产物（实验组）。

DNA pull-down 蛋白银染图

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